PM2.5對HUVEC毒性及對ROS、MDA、LDH水平影響

嵇志剛 李天來 徐藝 王甜

細顆粒物(PM2.5)指空氣動力學直徑≤2.5 μm顆粒物,是霧霾重要組成成分,可長時間懸浮于空氣中,對環境質量和人體健康等可造成嚴重危害,有研究顯示PM2.5暴露與人群疾病死亡率、發病率以及住院率增加密切相關[1,2],且PM2.5每升高10 μg/m3,呼吸和心腦血管入院風險分別增加0.640%、0.697%,WHO在2005年制定PM2.5的準則值,其年均值為10 μg/m3,日均值為25 μg/m3,我國在2012年將PM2.5納入空氣檢測指標,規定日均值為75 μg/m3,年均值為35 μg/m3(GB3095-2012),并且建立相應檢測點[3]。PM2.5具有粒徑小、表面積大的特點,其表面吸附了大量有機化學物質、重金屬和病原微生物等,同時因為在大氣中滯留時間長、輸送距離遠,被人體吸入的機會多,并且可以隨呼吸至下呼吸道,其中0.1 μm的顆粒物可以通過氣血屏障進入血液循環,對人體健康可以產生嚴重危害,隨著我國工業化進程的發展,PM2.5為主要成分的空氣污染已經成了影響人們健康主要原因,主要危害存在于呼吸系統和心血管系統等慢性疾病方面[4,5]。本文通過不同濃度的PM2.5染毒人臍靜脈內皮細胞(HUVEC),觀察PM2.5毒性,報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗試劑:HUVEC來源西安交通大學口腔醫院惠贈;實驗試劑:Tefion濾膜(購自北京海成世潔過濾器材有限公司)、RPMI-1640培養基(美國Hyclone公司)、胎牛血清(FBS,美國Hyclone公司)、胰蛋白酶(美國Genview公司)、雙抗(北京愛普華美生物科技有限公司)、DMSO(購自西安國安生物科技有限公司)、四甲基偶氮唑鹽(MTT,美國Amresco公司)、焦碳酸二乙酯(DEPC,德國Sigma公司)、微量丙二醛(MDA)測試試劑盒(南京建成生物工程研究所)、乳酸脫氫酶(LDH)測試試劑盒(南京建成生物工程研究所)、活性氧(ROS)測試試劑盒(南京建成生物工程研究所)、MMP檢測試劑盒(JC-1)(碧云天)、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(南京建成生物工程研究所)。(2)實驗設備:KB-120F型智能TSP-PM2.5中流量采樣器(青島金仕達電子科技有限公司)、HEPA CO2培養箱(美國,Thermo Forma 公司)、透氣培養瓶(加拿大,LabServ公司)、96孔板(加拿大,LabServ公司)、24孔板(加拿大,LabServ公司)、6孔板(加拿大,LabServ公司)、細胞計數板(上海化科實驗器材有限公司)、Infinite M200酶標儀(瑞士,TECAN公司)、倒置顯微鏡(日本,OLYMPUS公司)、流式細胞儀(BD FACSCalibur)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5樣品采集和處理:采樣前將Teflon濾膜干燥平衡24 h,然后稱量(ml),按照采樣規范在約離地面21 m處進行采集,連續采集14 h,采樣時詳細記錄采樣日期、樣品編號、采樣體積、氣象條件等;采完樣后將濾膜取下繼續平衡24 h后稱重(m2),m2-m1即為采集重量,PM2.5樣品采集及洗脫具體參考文獻[6]。

1.2.2 PM2.5染毒濃度設計與配制:實驗前配制4 mg/ml的大氣細顆粒物懸液為母液,根據參考文獻及前期預實驗的結果,大氣細顆粒物染毒濃度設計為25、50、100、200、300、400 μg/ml濃度染毒,同時設置對照組。實驗前將母液用1640完全培養液稀釋到上述濃度。

1.2.3 MTT法測定HUVEC細胞增值情況:應用MTT法檢測細胞活性,取對數期生長較好細胞,按照以5×104個/ml的密度,接種于96孔板進行培養,同時設置調零組、對照組、25、50、100、200、300、400 μg/ml染毒組,每組5個復孔;將染毒好細胞放入細胞培養箱進行培養6、12、18、24、36 h;培養時間結束,避光每孔加入配制好的濃度的5 mg/ml的 MTT 溶液20 μl,繼續孵育4～6 h,每孔加入200 μl DMSO,在波長550 nm酶標儀中,檢測每孔吸光度(OD值)。

1.2.4 MDA、LDH及ROS檢測:將對數期生長較好細胞,按1×104個/孔,接種于96孔板上,培養細胞貼壁后染毒,設置調零組,對照組、25、50、100、200、300、400 μg/ml染毒組,每組5個復孔,染毒24 h吸取上清液,嚴格按照MDA、LDH、ROS試劑盒試劑盒操作步驟進行。

1.2.5 細胞凋亡率檢測:取處在對數生長期細胞,以1×106個/ml密度,接種于6孔板,培養細胞貼壁后染毒,設置調零組,對照組、25、50、100、200、300 μg/ml染毒組,每組3個復孔,染毒24 h,染毒結束把細胞培養液吸出至離心管內,0.25%胰酶細胞消化液消化細胞,1 000 g離心5 min,棄上清,收集細并計數,加入5 μl Annexin V-FITC,混勻,再加入5 μl碘化丙啶,混勻,室溫避光孵育10min,隨即進行流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 PM2.5染毒對HUVEC存活率影響 染毒6、12、18、24、36 h隨著染毒劑量升高,細胞存活率均逐漸降低,同一染毒濃度隨著染毒時間延長,細胞存活率同樣下降(P<0.05),且在染毒36 h,PM2.5濃度為400 μg/ml,細胞存活率僅為45.23%。見表1。

表1 PM2.5不同染毒劑量、不同染毒時間HUVEC細胞生長存活率 %,

2.2 PM2.5染毒對HUVEC MDA、LDH及ROS水平影響 PM2.5染毒HUVEC 24 h后,MDA、LDH、ROS水平,均隨著染毒劑量增加而升高,且300、400 μg/ml達到最大值,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 PM2.5染毒對HUVEC MDA、LDH及ROS水平影響

2.3 PM2.5染毒對HUVEC細胞凋亡率的影響 經過PM2.5染毒后細胞早期凋亡率、中晚期凋亡率以及死亡細胞率均隨著染毒濃度升高具有上升趨勢,其中早期凋亡率變化最為明顯,差異有統計學意義(P<0.05)(早期凋亡率隨著濃度均迅速上升,中晚期凋亡率和死亡率變化緩慢)。見表3,圖1。

圖1 不同PM2.5濃度染毒細胞24 h后流失細胞圖

表3 不同PM2.5濃度染毒細胞24h后細胞凋亡率變化

3 討論

PM2.5污染是造成環境污染重要因素之一,有研究顯示,>65歲的人群發現PM2.5每增加1.71 μg/m3,呼吸疾病以及心血管疾病的住院率分別增加3.47%、2.11%等[7],目前認為PM2.5致病機制主要為自由基過氧化機制、轉錄因子和炎性質因子激活等[8,9],認為PM2.5進入機體后可以誘發自由基可直接對DNA產生氧化損害,并且可以刺激機體產生大量的炎性因子等。

本文通過MTT實驗顯示在PM2.5染毒6、12、18、24、36 h隨著染毒劑量升高,細胞存活率均逐漸降低,同一染毒濃度隨著染毒時間延長,細胞存活率同樣下降(P<0.05),且在染毒36 h,PM2.5濃度為400 μg/ml,細胞存活率僅為45.23%,這個不能滿足實驗要求,說明PM2.5對血管內皮細胞的增殖有明顯的抑制作用,并呈現劑量-反應關系,這一結果可解釋為PM2.5染毒導致細胞內發生氧化應激反應、DNA損傷等,從而降低細胞的增殖能力,說明PM2.5對HUVEC細胞具有明顯的毒性效應。

ROS在氧化應激、動脈粥樣硬化疾病中起著重要的作用[10]。不同濃度PM2.5染毒HUVEC 24 h后ROS水平隨著染毒劑量增加而升高,說明PM2.5染毒可以誘導ROS形成,可能進而誘導細胞發生凋亡或者死亡等。MDA是人體膜脂過氧化最為重要的產物之一,MDA的產生可以加劇細胞膜的損傷,因此MDA在毒性細胞研究中最為常見的指標,可以通過MDA的表達水平了解脂質過氧化程度,進而測定膜受損程度等[11],本結果顯示MDA表達水平隨著PM2.5濃度的增加逐漸升高,并且在300、400 μg/ml升高更加明顯,說明PM2.5染毒誘發了脂質過氧化反應,促進細胞凋亡,同樣也有研究顯高水平的MDA會引起蛋白質、核酸等生物大分子的聚合,具有明顯細胞毒性,也有研究發現MDA影響線粒體呼吸鏈復合物及關鍵酶作用,同樣反應脂質過氧化程度,間接反應機體受自由基的損傷程度等。LDH是一種糖酵解酶,可以催化乳酸生成丙酮酸,存在組織細胞胞質內,正常情況下不能透過細胞膜,如果細胞膜受到損傷或者破裂,LDH就會漏出,因此通過檢測LDH漏出量間接反應細胞受損傷程度[12],本研究結果為HUVEC細胞LDH漏出量隨著PM2.5濃度升高逐漸升高,存在明顯劑量反應關系,說明PM2.5染毒后細胞膜通透性可能增加或者細胞張力降低,這是細胞趨向凋亡的過程,因此也反應可能在細胞凋亡中過程起著一定作用。

細胞凋亡是由細胞基因控制的程序化死亡,是細胞為了適應生存環境而自身調節死亡過程,外界因素通過各種途徑誘發細胞凋亡調控異常就會引起疾病的發生[13]。大量文獻研究顯示毒物誘導細胞凋亡線粒體依賴途徑起著主要作用,本文通過采流式細胞儀檢測染毒后細胞凋亡率,結果顯示隨著PM2.5染毒劑量增加,細胞早期凋亡率、中晚期凋亡率以及死亡細胞率等均具有上升趨勢,其中細胞早期凋亡率變化最為明顯,說明細胞早期對于PM2.5毒性最為敏感,同時反應對細胞損傷程度,在PM2.5濃度為300 μg/ml細胞凋亡率大約在65.96%,說明高濃度的PM2.5可以誘發細胞大部分凋亡,細胞過度凋亡可能是某些疾病始發病因,比如動脈粥樣硬化,因此認為PM2.5可能是誘發或者促進疾病發生的危險因素。

綜上所述,PM2.5染毒對HUVEC細胞產生了明顯的毒性作用,并且隨著濃度升高毒性增強,對細胞損傷增大,并且可能促進細胞凋亡率升高。