兩種化學發光法檢測25-羥基維生素D的性能差異及結果一致性評價

常麗 馮蘇 趙東蘭 王超 程麗姍 宋國威 李立新

當前,全球有近十億人普遍存在維生素D不足或者缺乏的情況,維生素D的缺乏是一個日益嚴重的全球性問題。維生素D是維持骨骼健康的主要元素。兒童期維生素D的嚴重缺乏將導致骨骼畸形,即佝僂病。輕度缺乏將導致食物鈣的利用效率下降[1]。維生素D缺乏將導致肌肉乏力;對于中老年人,維生素D對肌肉功能的影響還造成跌倒風險。迄今為止,已發現維生素D可影響200多種不同基因的表達。維生素D缺乏與糖尿病、不同種類的癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病和先天性免疫性疾病有關[2]。可見,實驗室開展檢測維生素D項目,對疾病的預防、診斷及治療具有十分重要的作用。血清 25-羥基維生素 D濃度被認為是測定全面維生素D狀態的最可靠指標[3]。化學發光免疫分析儀是臨床常用的診療分析儀器,國內大型醫院多引進國外進口設備,近年來我國醫改政策不斷調整,國產品牌儀器也逐步興起。但不同品牌的化學發光免疫分析儀的具體性能存在差異,此研究依據性能評價要求,應用新產業M4000P及羅氏Cobas e411兩種檢測平臺作為國產和進口化學發光分析儀的代表,檢測25-羥基維生素D的以下性能指標: 精密度、 正確度、線性范圍、生物參考區間,以評估 2個檢測平臺的檢測結果能否滿足臨床檢測需求并對檢測結果的相關性進行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 145例石家莊地區>60歲的老年人空腹血清,將以上樣本分別在新產業M4000P和羅氏Cobas e411檢測平臺上進行分析。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 新產業M4000P:直接化學發光法:試劑名稱:25-羥基維生素 D(25-OH Vitamin D)測定試劑盒(化學發光法),批號:1031900301,參考區間:30～100 ng/ml;質控品 level1 10319008011,level210319008012。

1.2.2 羅氏Cobas e411:電化學發光法,試劑名稱:25-羥基維生素 D(25-OH Vitamin D)測定試劑盒(電化學發光法),使用試劑批號:341671,參考區間:20～32 ng/ml,質控品 level1 276842,level2 276843。

1.3 性能驗證

1.3.1 精密度驗證:依據中華人民共和國衛生行業標準《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》[4],按照與臨床標本相同的檢測方法,2個濃度的質控品,每個濃度水平同一樣品重復測定3次,連續測定5 d。判斷標準:以國家衛健委室間質量評價限作為允許總誤差TEa,批內精密度<1/4TEa,批間精密度<1/3TEa。

1.3.2 正確度驗證:依據中華人民共和國衛生行業標準WS/T492-2016《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》[4],按照與臨床標本相同的檢測方法,采用兩個濃度的工作校準品,每個濃度重復檢測2次,連續檢測5 d。單個項目的偏倚=(檢測值-靶值)/靶值*100%,平均偏倚=︱偏倚︱的和/5,計算平均偏倚,平均偏倚<1/2TEa(12.5%)即為該項目驗證通過。

1.3.3 線性區間驗證:依據CNAS-GL037《臨床化學定量檢驗程序性能驗證指南》中6.4線性區間驗證[5],分別選取性能指標中線性區間新產業線性10～150 ng/ml和羅氏0～30 ng/ml內的高值血清標本H(標本1)和低值血清標本L(標本5)各1份,并按比例配制標本2(3L+1H)、標本3(2L+2H)、標本4(1L+3H)共5個濃度系列血清,每個濃度測2次,測得均值與理論值做直線回歸得到Y=bX+a。b在0.95～1.05范圍內,r2≥0.95(r≥0.975)可初步判斷線性范圍符合要求。

1.3.4 稀釋倍數驗證:收集接近線性區間上限的患者血清檢測3次,按照稀釋倍數計算稀釋后的理論值,并按照說明書建議的稀釋倍數用儀器自動稀釋得出實測值,同樣重復檢測3次,計算回收率R。如80%≤R≤120%則該稀釋倍數通過驗證。

1.3.5 參考區間驗證:依據 CLSI C28-A3c[6],選取本院健康體檢中心表觀健康者樣本20例進行檢測,驗證試劑盒給定參考區間的適用性。判斷標準:若20例表觀健康者檢測結果≤2例在參考區間之外,則該參考區間驗證通過;若>2例超出參考區間之外,則需找出原因重新驗證或自行建立參考區間。

1.4 2種方法檢測維生素D的結果一致性評價 依據CLSI EP09-A3文件,采用直接化學發光法和電化學發光法檢測145例血清樣本維生素D,所得結果采用組內相關系數(intraclass correlation efficient,ICC)和Bland-Altman偏差分析法進行2組數據的一致性評價。

1.5 統計學分析 應用SPSS 21.0統計學軟件對組內相關性系數進行評價,如ICC值>0.75,則認為2組數據一致性良好;采用GraphPad Prism8.0軟件進行Bland-Altman偏差分析,以X±1.96s作為一致性界限。

2 結果

2.1 2種檢測平臺結果分析

2.1.1 精密度分析:新產業M4000P、羅氏Cobas e411。見表1。

表1 精密度評價表

2.1.2 2種檢測平臺正確度評價:新產業M4000P、羅氏Cobas e411兩種檢測平臺的平均偏倚均<12.5%,正確度驗證通過。見表2。

表2 正確度驗證

2.1.3 線性區間驗證:選取新產業M4000P低濃度10.27 ng/ml和高濃度119.55 ng/ml,羅氏Cobas e411低濃度3.05 ng/ml和高濃度67.8 ng/ml,按照0∶4、1∶3、2∶2、3∶1和4∶0的比例稀釋后進行線性分析,經線性擬合方程為Y=0.99X+0.575,r2=0.9997和Y=0.9969X+0.5523,r2=0.9996。見圖1。

2.1.4 稀釋倍數驗證:新產業M4000P維生素D線性區間為10～150 ng/ml,線性區間足夠大,臨床樣本不涉及稀釋問題,故未進行稀釋倍數驗證。羅氏Cobas e411維生素D線性區間0～30 ng/ml,對其推薦的稀釋倍數2倍做驗證,驗證通過,羅氏Cobas e411維生素D臨床可報告范圍上限到135.54 ng/ml。見表3。

表3 電化學發光法驗證維生素D稀釋倍數

2.1.5 兩種檢測平臺參考區間比較:選擇20個合格的樣本,將檢驗結果與參考區間比較,超出參考區間數據≤10%,通過驗證;>10%,則分析原因后驗證。新產業M4000P,羅氏Cobas e411均符合標準。見表4。

表4 參考區間驗證結果

2.2 2種檢測平臺檢測數據一致性分析

2.2.1 組內相關系數:收集的145例石家莊地區>60歲老年人空腹血清分別用直接化學發光法和電化學發光法進行維生素D檢測,應用SPSS 21.0統計學軟件進行數據一致性分析。組間比較差異有統計學意義(P<0.001),兩種化學發光法檢測的VD結果數據間具有顯著相關性,一致性相關系數ICC=0.925,ICC>0.9,提示兩種化學發光法檢測維生素D結果一致性極好。

2.2.2 Bland-Altman偏差分析:新產業M4000P的直接化學發光法和羅氏Cobas e411電化學發光法進行維生素D檢測結果在收集的檢測均值偏低范圍(7.65～20 ng/ml)表現出極佳的一致性,在中間偏高范圍(20～60.68 ng/ml)的一致性稍有遜色。隨VD濃度增大,偏差增大的可能性增大。其中有5.5%(8/145)的點在95%的一致性界限(差值的均值±1.96SD)之外,一致性上限以上的點(2個)少于在一致性下限以下的點(6個),差值絕對值最大可達12.52 ng/ml(一致性界限為-6.7～5.18)。2種方法隨VD濃度越大在約>20 ng/ml,偏差增大的可能性越大。見圖2。

圖2 兩種方法檢測VD的Bland-Altman偏差分析

3 討論

25-羥基維生素D是應在血中被檢測的代謝物,由于它是人體內維生素D的主要儲存形式,通過檢測它可以確定總維生素D的情況[7,8]。此研究依據CNAS-GL037《臨床化學定量檢驗程序性能驗證指南》中的性能驗證要求,對直接化學發光法和電化學發光法25-羥基維生素D檢測的正確度、精密度、線性范圍和參考區間等進行驗證,驗證結果表明25-羥基維生素D性能符合臨床檢測需求。新產業M4000P的直接化學發光法與羅氏Cobas e411的電化學發光法檢測25-羥基維生素D的正確度即偏倚均滿足1/2TEa要求。25-羥基維生素D直接化學發光法檢測的精密度兩個水平2.49%和1.63%,電化學發光法精密度為5.37%和3.64%,均滿足各自說明書聲明的精密度要求,但德國羅氏Cobas e411電化學發光法在精密度方面表現較國產新產業M4000P直接化學發光法略差,分析原因由于新產業M4000P為新裝機,而羅氏Cobas e411使用年限較久導致。直接化學發光法的25-羥基維生素D線性區間為10～150 ng/ml,電化學發光法為3～70 ng/ml,經驗證在其線性區間范圍內線性極好,但二者線性差異較大可能與二者檢測方法學不同有關:依據二者試劑檢測說明書,雖二者檢測均為免疫競爭法,但兩個檢測平臺檢測原理不同,其所制備抗體、相應的抗原結合位點及所依托的反應體系技術也不同,導致該檢測項目的線性區間有較大差異。由于直接化學發光法線性區間足夠大,臨床樣本很少涉及稀釋,因此只對電化學發光法的25-羥基維生素D做了稀釋倍數驗證,驗證后檢測范圍和直接化學發光法接近。

2種方法的參考區間隨差距較大,但也驗證通過,推測可能同樣由于方法學體系的差異產生。本研究組內相關系數ICC達到了0.925,表現出極好的一致性,與兩種方法溯源一致有關:新產業M4000P的25-羥基維生素D校準品溯源為美國國家標準與技術研究院(NIST)標準參考物質SRM972a,而羅氏Cobas e411的25-羥基維生素D可溯源至LC-MS/MS,并可進一步溯源至NIST標準。2種方法的Bland-Altman偏差分析顯示出在檢測均值偏低范圍(7.65～20 ng/ml)結果的一致性更好,隨VD檢測值增大約>20 ng/ml,偏差增大的可能性增大。這與譚延國[9]對不同化學發光方法檢測生長激素的一致性研究基本一致,結果顯示隨生長激素水平遞增,不同方法的檢測系統間的水平差異夜呈比例遞增。

基于各臨床實驗室出具的25-羥基維生素D報告單中,同一檢測樣本涉及到使用的不同方法學的檢測項目結果可能會有所差異,為保證檢驗結果的可比性,應在報告單上備注所使用的檢測方法學,以便于不同方法學的檢驗結果的分析。而對有方法學差異的檢測項目,實驗室間質量評價及檢驗結果互認工作也是基于相同檢測方法、相同檢測儀器甚至是相同試劑,因此對于同一檢驗項目有不同檢驗方法的情況應依據各臨床醫學實驗室的具體情況綜合分析。