急性溫度脅迫對紅耳龜消化、免疫功能的影響及維生素E 的干預效應

朱天生，李亦婷，傅麗容 ，史海濤

（海南師范大學生命科學學院，熱帶島嶼生態學教育部重點實驗室，海口 571158）

龜類的生長發育受諸多外界環境因素的影響，水溫直接關系其攝食、代謝、生長、發育、繁殖等生命過程。極端的天氣現象、臺風后養殖池遭雨水入侵、高溫運輸引起中暑或是引入地和養殖地之間溫差過大等原因，均會引起龜鱉的應激反應（曹鑫盛等，2019）。中國急性溫度變化多發生于5—10 月，6、7 月尤為集中（Zhanget al.，2015）。急性低溫脅迫可對中華鱉Pelodiscus sinensis不同腸段的腸道黏膜結構造成不同程度損傷，導致大腸黏膜的機械屏障功能下降，消化吸收功能減弱（邢瀟等，2019），且隨著急性溫度脅迫的程度加劇和時間延長，中華鱉的血漿抑菌效果和免疫力會降低（申思仙，2018；申思仙等，2018）；急性低溫脅迫亦可損傷虹鱒Oncorhynchus mykiss肝臟，導致其代謝能力下降（管標等，2014），造成中華鱘Acipenser sinensi（管敏等，2019）、銀鯧Pampus argenteus幼魚（謝明媚等，2015）體內產生大量活性氧自由基，從而造成細胞和組織損傷。冬眠狀態下的黃喉擬水龜Mauremys mutica遭受急性高溫脅迫時會產生一定程度的氧化損傷（陳威等，2019）。由此可見，急性溫度脅迫會嚴重影響水產動物的體質健康和生長發育。

如何采取有效抗應激措施已引起人們的關注。維生素E（vitamin E，VE），又被稱為生育酚、生殖維生素等（王磊，2021），具有抗氧化、提高生育能力、增強免疫力、維持細胞呼吸等多重功能（夏兆飛，2003），常作為免疫佐劑添入飼料中以提高動物的生產性能和抗應激能力。VE在緩解溫度應激帶來的不利影響方面具有良好效果。飼料中添加適量的VE 可顯著提高冷應激下籠養蛋鴨（陳鑫等，2008）和羅非魚Oreochromis niloticus幼魚（Xuet al.，2020）的生長性能，增加體重，降低飼料轉化率；亦可顯著降低日本鵪鶉Coturnix coturnix japonica血清中丙二醛和膽固醇水平（Sahinet al.，2003），在冷脅迫下羅非魚幼魚中同樣發現VE 顯著降低肝臟、肌肉和血清中的丙二醛含量，并伴隨超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶、總抗氧化力的顯著上升（Xuet al.，2020）。VE 對緩解高溫脅迫的作用在禽類養殖中被廣泛研究。Calik 等（2022）研究發現，高溫應激下VE 與硒連用顯著降低了HSPs、TLR2、TNFa、IFNg 等多種與氧化應激、免疫和腸道完整性相關基因的mRNA 豐度，減輕了高溫造成的不利影響。Pirgozliev 等（2020）的研究發現，VE 改善了高溫應激導致的肝臟和脾臟重量降低，這可能與VE 增加胃腸道中的飼料通過率，進而提高消化酶活性有關。Gouda 等（2020）在飼料中添加200 IU·kg-1VE顯著提高了40日齡日本鵪鶉的體重、采食量，降低了飼料轉化率，血液總抗氧化能力、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶也得到了顯著改善。Mazur-Ku?nirek 等（2019）同樣報道了飼料添加200 mg·kg-1VE對高溫應激ROSS 308肉仔雞氧化損傷的緩解。在龜鱉動物中，250 mg·kg-1是提高機體抗應激能力的適宜劑量（Zhouet al.，2004；雷金洪等，2022）。

紅耳龜Trachemys scripta elegans個體大、生長快、生命力強，因飼養成本低受到養殖戶的青睞而被大規模養殖，在國內龜鱉養殖類市場中占據了絕對的數量優勢（李韶清，2016；周鵬，2020）。本研究聚焦環境溫度急劇升高和降低對紅耳龜腸道消化酶和血清抗氧化指標的影響，探索溫度急性變化影響龜鱉動物消化功能和免疫功能的作用機理，并采取日糧中添加VE 的干預方式，研究VE 對急性溫度變化引起應激反應的防御作用，為龜鱉養殖過程中緩解應激、減少損失提供理論參考和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紅耳龜幼龜購自海南省海口市東山泓旺養殖場，飼養于龜鱉研究室，飼養箱長48 cm×寬36 cm×高21 cm，30 ℃室溫下暫養，每2 d 于18∶00 定時投喂1 次，4 h 后清理剩余飼料。所用飼料為佛山市順德區海皇實業有限公司生產的鱉（甲）魚配合飼料（表1），將餌料添加少量水和成面團后投喂，投喂量保證每次有剩余。暫養2周，待試驗用龜充分適應環境后，挑選健康個體開始試驗。

表1 基礎日糧主要營養成分及其含量Table 1 Approximate nutritional ingredient and contents of basal diet

1.2 實驗設計

選取112 只健康紅耳龜幼龜個體，體重為108.58 g±19.06 g，隨機均分成未添加VE 組和添加VE 組，每組分為室溫組（30 ℃，n=8）、急性高溫脅迫組（35 ℃，n=24）和急性低溫脅迫組（17 ℃，n=24），組間個體體重差異不顯著（P＞0.05）。在30 ℃下馴化飼養4 周，脅迫前禁食24 h，將裝有幼龜的養殖箱放入恒溫培養箱中，使養殖箱中水體溫度在2 h內達到脅迫溫度。

1.3 處理與采樣

室溫組直接取樣，急性高溫脅迫組與急性低溫脅迫組分別于達到脅迫溫度后0 h、6 h、12 h 采樣。每個溫度脅迫組隨機選取8只幼龜，斷頸法迅速處死并采血。血樣4 ℃中靜置2 h，4 ℃ 3 500 r·min-110 min，取上清液-80 ℃保存。另取適量小腸用SCIENTZ-48高通量組織研磨機制備成10%的組織勻漿，4℃ 10 000 r·min-110 min，取上清液-80 ℃保存。

1.4 消化酶及抗氧化酶活性的測定

試驗選用南京建成生物研究所生產的試劑盒，測定血清中的SOD、CAT 活性和谷胱甘肽（GSH）含量，以及組織勻漿上清液中的胃蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。具體操作方法嚴格按照各說明書進行。

1.5 數據處理

實驗測得數據用Excel 2010 整理，酶活性均用xˉ±SE 表示。采用F檢驗各組方差齊性，采用SPSS 19.0進行單因素方差分析，不同處理間多重比較采用LSD 法進行差異顯著性檢驗，并利用Origin 2019b繪圖。

2 實驗結果

2.1 不同處理對紅耳龜腸道消化酶活性的影響

2.1.1 急性溫度脅迫對胃蛋白酶活性的影響及VE 的干預效應未添加VE 組中，急性低溫脅迫組各時段胃蛋白酶活性與室溫組均無顯著差異（P＞0.05）；急性高溫脅迫組隨脅迫時間延長，胃蛋白酶活性表現為先升后降，6 h 時最高（P＜0.01）（圖1：A）。

圖1 不同處理下紅耳龜胃蛋白酶活性Fig. 1 Pepsin activity in Trachemys scripta elegans under different treatment conditions

添加VE 組在室溫下的胃蛋白酶活性顯著高于未添加VE 組（P＜0.05）；在急性低溫脅迫下的變化與未添加VE 組的趨勢一致，隨時間增加，呈先上升后下降的趨勢，且各時段明顯高于未添加VE 組，6 h 時的差異極顯著（P＜0.01），12 h 時的差異不顯著（P＞0.05）（圖1：B）。在急性高溫脅迫下，添加VE 組胃蛋白酶0 h 時的活性高于未添加VE 組（P＜0.05），隨后下降，各時段變化不明顯，添 加VE 組6 h 時未出現突增高 峰（P＜0.01）（圖1：C）。

2.1.2 急性溫度脅迫對淀粉酶活性的影響及VE的干預效應未添加VE 組中，急性低溫脅迫組的淀粉酶活性逐漸上升，至12 h 時顯著高于室溫組；急性高溫脅迫組的淀粉酶活性稍有波動，但與室溫組間的差異均不顯著（P＞0.05）（圖2：A）。

圖2 不同處理下紅耳龜淀粉酶活性Fig. 2 Amylase activity in Trachemys scripta elegans under different treatment conditions

添加VE 組的淀粉酶活性在急性低溫脅迫下表現為先上升后下降，從30 ℃降溫到17 ℃時，活性升至最高（P＜0.05），隨著脅迫時間延長，活性下降，6 h 后，低于未添加VE 組（P＞0.05）（圖2：B）。在急性高溫脅迫下，添加VE 組的淀粉酶活性先下降后上升，從30 ℃升溫到35 ℃時，活性下降，隨后逐漸升高，12 h 時顯著高于未添加VE 組（P＜0.05）（圖2：C）。

2.1.3 急性溫度脅迫對脂肪酶活性的影響及VE的干預效應在急性低溫脅迫過程中，未添加VE組各時段的腸道脂肪酶活性均高于室溫組，其中脅迫6 h時的差異顯著（P＜0.05）。急性高溫脅迫組的脂肪酶活性較室溫組均略有上升，但差異不顯著（P＞0.05）（圖3：A）。

圖3 不同處理下紅耳龜脂肪酶活性Fig. 3 Lipase activity in Trachemys scripta elegans under different treatment conditions

急性低溫脅迫過程中，添加VE 組的脂肪酶活性變化趨勢與未添加VE 組相似，且各時段均低于未添加VE 組，6 h 時的組間差異顯著（圖3：B）。在急性高溫脅迫下，添加VE 組的脂肪酶活性呈上升趨勢，均高于未添加VE 組，但差異不顯著（P＞0.05）（圖3：C）。

2.2 不同處理對紅耳龜抗氧化功能的影響

2.2.1 急性溫度脅迫對SOD活性的影響及VE的干預效應未添加VE 組經過急性低溫脅迫和急性高溫脅迫處理后的SOD 變化趨勢相似，均表現為先上升后下降（圖4：A）。急性低溫脅迫組各時段的SOD 活性均與室溫組的差異不顯著。急性高溫脅迫組從開始至脅迫12 h，SOD 活性均顯著高于室溫組（P＜0.05），6 h 后稍有下降，但仍高于室溫組。

圖4 不同處理下紅耳龜超氧化物歧化酶活性Fig. 4 Superoxide dismutase （SOD） activity in Trachemys scripta elegans under different treatment conditions

添加VE 組的SOD 活性在急性低溫脅迫和急性高溫脅迫下略低于未添加VE 組，急性低溫脅迫下的組間差異不顯著（P＞0.05）；急性高溫脅迫下，SOD 活性在0 h 和6 h 時，添加VE 組顯著低于未添加VE組（P＜0.05）（圖4：B，C）。

2.2.2 急性溫度脅迫對血清CAT 活性的影響及VE 的干預效應同一急性溫度處理內未添加VE組的血清CAT 活性稍有波動，但相互間無顯著差異（P＞0.05）（圖5：A）。急性低溫、高溫脅迫下添加VE 組的CAT 活性均略高于不添加VE 組，差異不顯著（P＞0.05）（圖5：B，C）。

2.2.3 急性溫度脅迫對GSH 含量影響及VE 的干預效應未添加VE組在急性低溫、高溫脅迫下，GSH 含量均明顯低于室溫組（P＜0.05）（圖6：A）。在室溫下，添加VE 組的GSH 含量顯著低于未添加VE 組（P＜0.05），急性低溫脅迫導致添加VE 組的GSH 含量上升，且接近未添加VE 組，至無顯著差異（P＞0.05）（圖6：B）；急性高溫脅迫6 h 時，添加VE 組的GSH 含量上升，顯著高于未添加VE 組（P＜0.05），脅迫12 h 下降，顯著低于未添加VE 組（P＜0.05）（圖6：C）。

圖6 不同處理下紅耳龜血清中的谷胱甘肽含量Fig. 6 Glutathione （GSH） content in the serum of Trachemys scripta elegans under different treatment conditions

3 討論

3.1 急性溫度脅迫對紅耳龜消化酶活性的影響及VE的干預效應

養殖溫度的急劇變化深刻影響著動物體的各項生理機能（Zhouet al.，2010）。急性低溫脅迫可降低水產動物的攝食量和酶活性，亦可導致肝臟損傷和生長相關基因表達下降，從而降低代謝速率和生長速度（管標等，2014；劉玲等，2018）；急性高溫脅迫可使體內酶失活，攝食量不穩定，破壞消化、排泄系統，進而影響正常生理功能（劉玲等，2018；張晨光等，2021）。管敏等（2019）的研究發現，急性低溫脅迫導致中華鱘子二代個體腸道淀粉酶活性顯著降低，而脂肪酶和胃蛋白酶活性沒有顯著變化。本研究中，急性低溫脅迫使紅耳龜的腸道脂肪酶和淀粉酶的活性升高，并分別在脅迫6 h 和12 h 時達到顯著差異水平。紅耳龜的溫度耐受性較強（李貴生，唐大由，2001），推測其在受到急性低溫脅迫時，機體淀粉酶和脂肪酶活性上調，增強了糖類和脂類的氧化分解，從而保證能量供應。雖然急性低溫脅迫過程中胃蛋白酶活性與室溫組間始終無顯著差異，但脅迫6 h 時酶活性顯著高于脅迫0 h 和12 h，提示急性低溫亦可能影響胃蛋白酶活性。張晨光等（2021）報道，急性高溫脅迫6 h 時，翹嘴鱖Siniperca chuatsi幼魚胃蛋白酶活性顯著降低，脂肪酶活性顯著升高，而淀粉酶活性沒有變化，但在脅迫48 h 后，胃蛋白酶和淀粉酶的活性顯著升高，脂肪酶活性顯著降低。本研究結果表明，紅耳龜胃蛋白酶活性在急性高溫脅迫6 h 較室溫組有極顯著升高，12 h 又恢復到室溫水平。劉丹（2011）報道紅耳龜幼龜偏好動物性食物，且飼料中蛋白質占比較高，據此推測胃蛋白酶活性的增強更利于其消化食物和提供能量以應對環境脅迫。淀粉酶和脂肪酶活性在急性高溫脅迫下無顯著變化，可能是其在應對此脅迫中不起主要作用，也可能由于脅迫周期較短未能觀察到之后的變化。

VE 可通過提高動物采食量和飼料利用率、增強腸道生長發育、提高消化酶活性等途徑提高生長性能（羅輝，2006）。日糧添加VE 后，中華鱉的抗應激能力有所提高，機體生長加快（周顯青等，2003；Zhouet al.，2004）。雷金洪等（2021）研究發現，長期高溫脅迫下飼料添加VE 可顯著提高紅耳龜胃蛋白酶活性，抑制脂肪酶活性，并提高特定生長率。本研究中急性低溫脅迫下，飼料添加VE 組的蛋白酶活性顯著升高，而脂肪酶活性則有降低的趨勢，提示在應對急性低溫脅迫時，VE可通過增強紅耳龜的蛋白質消化吸收增加能量供給。Liu等（2019）在對七彩魚Symphysodon haraldi的研究中同樣觀察到添加VE 組胃蛋白酶的升高和脂肪酶的降低；He 等（2017）報道，飼料添加50 mg·kg-1或100 mg·kg-1VE 能顯著提高斑點叉尾Ictalurus punctatus的脂肪酶活性。這可能是不同物種對膳食中VE 的響應機制不同，導致消化酶活性的具體變化不一致。面臨急性高溫脅迫時，添加VE 組的胃蛋白酶活性極顯著低于未添加VE 組，淀粉酶活性顯著高于未添加VE 組，脂肪酶活性較室溫組顯著升高，推測受急性高溫脅迫時，VE提高了紅耳龜腸道淀粉酶和脂肪酶在抗應激中的作用，減少了蛋白質的損耗。這與雷金洪等（2021）的實驗結果不同，可能是急性脅迫和長期脅迫機體供能機制有所不同，在長期高溫應激下VE 能持續有效保護和修復紅耳龜受損腸道，加強絨毛上皮細胞吸收，而以提高飼料中蛋白質利用率的方式提供更多能量以適應長期高溫脅迫（羅輝，2006）。就消化酶而言，急性高、低溫度脅迫造成的生理影響不同，飼喂VE 的改善效果與作用方式亦不同，其機理有待進一步研究。

3.2 急性溫度脅迫對紅耳龜抗氧化功能的影響及VE干預效應

抗氧化酶是生物體內保護預防相關的酶類，機體內的CAT 和SOD 活力能夠反映出機體清除自由基的能力（洪美玲等，2007）。外界溫度突然變化會引起龜鱉類動物的應激反應，刺激其體內的活性氧增多（Zhanget al.，2017）。面對急性高溫脅迫，黃喉擬水龜北種群組織中SOD 活力升高，過氧化氫酶活力不受溫度處理影響（陳威等，2019），與本研究結果相似，故推測，面對急性高溫脅迫，CAT可能在清除自由基的過程中不起主導作用，而SOD對緩解急性高溫應激較為重要。在急性低溫脅迫下，紅耳龜的SOD 和CAT 活性均無顯著變化，但CAT 活性出現下降趨勢（P＞0.05），可能是低溫對CAT 活性有一定的抑制作用。而管敏等（2019）研究報道，急性低溫脅迫造成子二代中華鱘的CAT活性顯著升高，但SOD 活性無顯著變化，可能是實驗物種的不同導致了反應模式存在差異（Mourenteet al.，2002）。本研究中未添加VE 組的GSH 含量在急性高、低溫度脅迫情況下均顯著降低，推測由于脅迫引起氧化損傷，造成紅耳龜體內活性氧增多，血清中大量GSH 被用于活性氧的清除而被消耗。同時急性溫度脅迫還可能影響谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽轉移酶的活性進而間接影響GSH含量（管敏等，2019）。

相關研究表明，日糧中添加適量的VE 可以在滿足水產動物生長發育需要的同時提高機體的抗氧化能力（許友卿等，2011），還可作為免疫調節物增強體液、細胞免疫和吞噬作用（夏兆飛，2003；曹國弟，趙恒壽，2007）。在對中華絨鰲蟹Eriocheirsinensis幼體進行亞硝酸鹽脅迫時，雖然添加VE 后沒有完全阻止SOD 活性的上升，但其上升幅度減小，與本研究結果相似。在受到脅迫產生活性氧時，機體可通過酶促和非酶促抗氧化防御機制，以及抗氧化劑清除氧自由基（Suraiet al.，2019）。本研究結果表明，VE 對紅耳龜抗氧化酶活性影響較小，其提高紅耳龜抗應激能力、減少超氧陰離子產生的效果可能主要是通過VE 的抗氧化劑特性實現，進而減緩了SOD 響應應激的強度（洪美玲，2007）。飼料添加VE 造成急性高、低溫度脅迫紅耳龜血清CAT 活性上升，但變化不顯著，這與謝盛蘭（2020）的研究結果一致，進一步說明了紅耳龜應對急性溫度脅迫造成的氧化損傷時，CAT可能并不起主導作用，也可能是因為實驗添加的VE 量尚不是最適宜的，無法大幅提高紅耳龜的抗氧化能力，有待后續實驗驗證。VE使急性高、低溫度脅迫下GSH 含量升高，這與李鵬飛等（2016）結果一致，在常溫下，VE 可能作為非酶抗氧化因子存在于幼龜血液中，使血清中GSH 含量低于正常水平，但在面對急性溫度脅迫時又可迅速引起非酶抗氧化系統的反應，引起GSH 含量的上升，而高水平的GSH可以迅速消除任何形式的活性氧（Joneset al.，1981），對經受氧化應激的生物體而言十分重要。

4 結論

急性高、低溫脅迫均可導致紅耳龜發生應激反應，龜體腸道消化酶活性和血液抗氧化酶活性也會發生不同程度的變化以應對脅迫，盡可能維持龜體內環境穩定，而飼料添加適宜劑量的VE 可能優化了龜體應對急性溫度脅迫的酶策略，進一步節省自身能量、緩解氧化應激，更有利于保持體質健康和生長發育。因而，在紅耳龜養殖生產、運輸等過程中應當盡量避免急劇的溫度變化，減少龜體應激，同時在日常喂食適宜劑量的VE 以增強龜體的抗逆性能。