北京動(dòng)物園圈養(yǎng)野生動(dòng)物病原菌分布及耐藥性分析

劉燕，詹同彤，胡昕，盧巖，郝菲兒，由玉巖，崔多英，劉赫，滑榮，張成林

（北京動(dòng)物園管理處，圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044）

病原菌一直是威脅圈養(yǎng)條件下野生動(dòng)物健康的重要因素之一（張成林等，2013；侯超鵬，2019）。抗生素對圈養(yǎng)動(dòng)物病原細(xì)菌感染治療可以起到良好的效果，但是條件性致病細(xì)菌的感染仍時(shí)有發(fā)生。在圈養(yǎng)條件下，不同種類野生動(dòng)物間以及野生動(dòng)物與人類包括游人和飼養(yǎng)員等近距離接觸機(jī)會(huì)大幅增加，人畜共患病原菌和耐藥菌在動(dòng)物間以及人與動(dòng)物間傳播的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加（秦春娥等，2007），對動(dòng)物和人類健康都會(huì)造成一定威脅，增加公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)（張勁碩等，2003）。因此，對圈養(yǎng)條件下動(dòng)物感染的病原菌分離、監(jiān)測非常重要。

北京動(dòng)物園飼養(yǎng)展示珍稀野生動(dòng)物約400 種5 000余只，發(fā)揮著國家動(dòng)物園功能，平均每年接待游客量近千萬，在圈養(yǎng)野生動(dòng)物疾病治療方面，多年來一直開展病死動(dòng)物的病原菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，本文統(tǒng)計(jì)了2005—2016 年12 年北京動(dòng)物園圈養(yǎng)的死亡和患病的537 只野生動(dòng)物的細(xì)菌感染情況，并分析了病原菌的分布特點(diǎn)和抗藥性，以期為臨床細(xì)菌性疾病治療中的藥物選擇提供參考，避免抗生素濫用和耐藥菌株產(chǎn)生、傳播、流行，并為制定野生動(dòng)物抗菌藥物應(yīng)用策略、管理措施及評價(jià)干預(yù)手段等提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

采集2005—2016 年北京動(dòng)物園死亡和患病的168 種537 只圈養(yǎng)野生動(dòng)物的935 份樣本，包括哺乳動(dòng)物99 種365 只、鳥類54 種143 只和兩棲爬行類15 種29 只，其中，死亡動(dòng)物424 只803 份樣本，患病動(dòng)物113 只132 份樣本。死亡動(dòng)物根據(jù)呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等死亡原因取肝臟、肺臟、脾臟、心臟、腎臟、腸道內(nèi)容物等病變臟器組織；患病動(dòng)物根據(jù)具體病情采集包括膿液、鼻腔分泌物、咽拭子等樣本。所有死亡動(dòng)物均在死亡5 h 內(nèi)進(jìn)行剖檢采樣，盡量減少雜菌污染。病變臟器采集采用75%乙醇溶液擦拭臟器表面后用無菌剪刀剪取3 cm×3 cm 組織，膿液采集使用無菌注射器抽取液體，鼻腔分泌物和咽喉、扁桃體采用無菌棉簽蘸取分泌物，放入無菌袋，立即4 ℃送檢。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

MH 培養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)瓊脂和普通營養(yǎng)培養(yǎng)瓊脂（青島海博生物技術(shù)有限公司）、10%脫纖維羊血營養(yǎng)瓊脂（自制）、API 鑒定試劑條（法國生物梅里埃股份有限公司）、藥敏片（北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司）等。

1.3 病原菌分離鑒定方法

將臟器樣本置于超凈工作臺(tái)，75%乙醇溶液擦拭消毒表面，用無菌剪刀剪去樣本表面組織后，用無菌接種針蘸取組織涂抹接種于10%脫纖維羊血營養(yǎng)瓊脂、MH 等培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。玻片革蘭氏染色后鏡檢。將鏡檢疑似為鏈球菌屬Streptococcus感染樣本置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，疑似魏氏梭菌Clostridium welchii感染樣本置于厭氧環(huán)境培養(yǎng)。培養(yǎng)24～48 h。分離菌株接種于血液瓊脂上培養(yǎng)，直至純化。將純化好的菌株接種于相關(guān)生化反應(yīng)管或API鑒定試劑條，進(jìn)行菌株鑒定。綜合鏡檢和培養(yǎng)結(jié)果綜合判定樣本中是否存在病原菌。

1.4 藥物敏感試驗(yàn)

將獲得的大腸桿菌Escherichia coli、葡萄球菌屬Staphylococcus、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae和奇異變形桿菌Proteus mirabilis按北京動(dòng)物園臨床治療常用的部分抗生素（頭孢克肟、頭孢曲松、慶大霉素、阿奇霉素、諾氟沙星、阿莫西林/克拉維酸、青霉素、磺胺）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)：用無菌棉簽蘸取待測菌的血清肉湯培養(yǎng)物，均勻涂布于10 cm 鮮血平板，待稍干后，用無菌鑷子將藥敏紙片分別平貼在培養(yǎng)基表面，4 ℃ 2 h 使藥物擴(kuò)散，然后37 ℃培養(yǎng)24 h，按照NCCLS（1999）標(biāo)準(zhǔn)判斷藥物敏感結(jié)果。使用大腸桿菌ATCC 25922菌株進(jìn)行質(zhì)控。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類動(dòng)物病原菌分離情況

307 只動(dòng)物樣本檢出病原菌，檢出率57.17%，其中，哺乳動(dòng)物56.16%，鳥類61.52%，兩棲爬行動(dòng)物48.27%。

2.2 不同病變臟器病原菌分離情況

病原菌檢出樣本共515份，占55.08%，其中，肝臟、肺臟的樣本比例較高，分別為31.33% 和22.46%；從標(biāo)本病原菌檢出率來看，肺臟（62.38%）最高，并高于肝臟（43.69%）（表1）。

表1 2005—2016年北京動(dòng)物園圈養(yǎng)野生動(dòng)物病/死動(dòng)物的樣本種類、數(shù)量和病原菌檢出率Table 1 Sample type，number and detection rate of bacterial pathogens from captive sick/dead animalsin Beijing Zoo from 2005 to 2016

2.3 病原菌分布

935份樣本共分離到580株細(xì)菌，其中，革蘭氏陰性菌372 株，占64.14%，主要是腸桿菌科Enterobacteriaceae；革蘭氏陽性菌208 株，占35.86%（表2），主要是鏈球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬Clostridium和葡萄球菌屬。條件性致病菌占絕大多數(shù)，包括大腸桿菌、鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa和魏氏梭菌等。

表2 2005—2016年北京動(dòng)物園圈養(yǎng)野生動(dòng)物病/死動(dòng)物病原菌信息Table 2 Pathogenic bacteria of captive sick/dead animals in Beijing Zoo from 2005 to 2016

2.4 耐藥性分析

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示（表3），4 種菌株對磺胺耐藥性最高（44.44%～78.57%），其次是對青霉素的耐藥性（25.00%～50.00%）。其他耐藥性較高的還有：葡萄球菌屬對頭孢克肟的耐藥性達(dá)到44.44%，大腸桿菌對阿莫西林/克拉維酸的耐藥性達(dá)到36.36%。

表3 4種主要病原菌對抗生素的耐藥結(jié)果Table 3 Drug resistance result of four kinds of pathogenic bacteria

3 討論

本文總結(jié)了2005—2016 年北京動(dòng)物園患病和死亡動(dòng)物的病原菌檢出率和耐藥情況，在待檢樣本數(shù)量上，哺乳動(dòng)物數(shù)量較多，鳥類較少，兩棲爬行類最少。總病原菌檢出率為57.17%，略低于杭州動(dòng)物園的65.19%（黃淑芳等，2017）。總體反映出細(xì)菌性感染疾病是北京動(dòng)物園圈養(yǎng)野生動(dòng)物發(fā)病和死亡的重要原因。

從病原菌分離的臟器類型來看，肺臟最高，說明呼吸道發(fā)生細(xì)菌性感染疾病幾率較高，這與尹秀云等（2014）的研究結(jié)果一致。從致病細(xì)菌類型來看，條件性致病菌占多數(shù)，如大腸桿菌、鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌和魏氏梭菌等。其中，61.52%鳥類樣本檢出的致病菌80%以上是大腸桿菌，說明圈養(yǎng)條件下，鳥類應(yīng)重點(diǎn)預(yù)防大腸桿菌的感染。可以通過提供最適營養(yǎng)配比的飼料、提高圈養(yǎng)環(huán)境條件、減少應(yīng)激反應(yīng)等提升動(dòng)物福利，最大限度減少致病菌大腸桿菌感染的幾率，保障圈養(yǎng)鳥類健康。

580 株菌株中，最多的革蘭氏陰性菌是腸桿菌科，而占比較高的是鏈球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬，其中，魏氏梭菌的分離率達(dá)到9.14%。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果看，大腸桿菌對磺胺、青霉素的耐藥性高達(dá)44.44%～78.57%，與已有報(bào)道（周萬蓉，2007；黃淑芳等，2011；劉青等，2020）相比，低于家畜源，而高于野生動(dòng)物源（梁冰等，2020；李運(yùn)莉等，2022；王東陽等，2022）。葡萄球菌對8 種抗生素普遍具有一定的耐藥性，但對諾氟沙星、慶大霉素較敏感，與已有研究結(jié)果（馬小萍等，2016；張志忠等，2017；王光鋒，李航，2020；吳勝等，2020）基本相同。肺炎克雷伯氏菌菌株對磺胺、青霉素等耐藥率非常高，對頭孢曲松、阿莫西林等較敏感，與此前報(bào)道的梅花鹿Cervus nippon源和東非黑白疣猴Colobus guereza源肺炎克雷伯氏菌對阿莫西林普遍耐藥（王艷君等，2018a；張召興等，2019；郭蕊等，2021；王煒強(qiáng)等，2022；燕霞等，2022）有一定差異。奇異變形桿菌菌株對8 種抗生素普遍較敏感，但對磺胺耐藥，與已有研究結(jié)果（龐卓等，2010；王麗萍等，2016；王艷君等，2018b；朱洪軍等，2019）較為一致。

綜上所述，圈養(yǎng)條件下細(xì)菌性疾病治療應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選用窄譜抗生素，避免耐藥菌株的出現(xiàn)。針對病原菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)非常必要，能反映圈養(yǎng)野生動(dòng)物源致病菌的抗生素耐藥情況，指導(dǎo)臨床用藥，可以避免耐藥菌株甚至超級菌的出現(xiàn)，減少人畜共患病發(fā)生的幾率。