龍膽苦甙上調大鼠LC3Ⅱ表達促進自噬緩解非酒精性脂肪性肝炎

丁潔 劉思奇 王藝穎 王霖 施承宏 王芳 常國楫 華麗娟 陳華憶 李生浩 王晴晴

昆明市第三人民醫院/云南省傳染性疾病臨床醫學中心 1肝病綜合科，2科教學術部，3病理科，4醫務部（昆明 650041）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與代謝應激有關的肝損傷，主要病因有胰島素抵抗和遺傳易感性，包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），其發病率在我國慢性肝病中排首位［1］，其中NASH 是肝硬化和HCC 發生的極高危因素。雖然維生素E 在NASH的治療中已取得一定的進展［2］，但迄今為止依然沒有十分有效的治療方法，迫切需要繼續探索新的有效的藥物治療。

目前研究顯示，NASH 的發生及進展為HCC與細胞自噬活性降低密切相關［3］，而且脂肪肝的噬脂過程調節不當是HCC 發展的重要因素，增加自噬活性可以改善肝脂肪變、炎癥及纖維化程度［4］。既往研究［5-6］表明龍膽苦甙（gentiopicroside，GPS）可通過調節自噬相關磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信號改善糖脂代謝。GPS 也能上調自噬相關Atg8 基因的表達調節自噬從而起到抗衰老作用［7］，同時GPS 還有明確的抗炎［8］、抗氧化應激和調節血脂［5］等作用。但GPS 是否能同樣改善NASH，以及LC3Ⅱ和自噬現象在其中的作用和具體機制目前尚未明確。本研究擬建立大鼠的NASH 模型，設置相應對照，給予GPS 治療，評價GPS 對NASH 治療效果，并初步探索LC3Ⅱ和自噬現象在其中的作用和具體的調控機制，旨在為NASH 的治療尋找新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器設備

1.1.1 實驗動物清潔級雄性斯潑累格-多雷（Sprague-Dawley，SD）大鼠44 只（6 周齡，體質量180～220 g）購于昆明醫科大學實驗動物中心，適應性喂養2 周后用于實驗。

1.1.2 實驗試劑和儀器設備LC3Ⅰ/Ⅱ Antibody（美國CST）、Actin β Antibody（美國Santa）、RNA 提取試劑盒（北京天根）、RNA 保存液（北京天根）、逆轉錄試劑盒（上海科敏）、Anti-GAPDH Antibody（杭州開泰）、IL-1β ELISA 檢測試劑盒（賽默飛世爾科技）、TNF-α ELISA 檢測試劑盒（賽默飛世爾科技）、基礎電泳儀（美國Bio-rad）、半干轉膜儀（美國Bio-rad）、Applied Biosystems PCR 熱循環儀（美國賽默飛）、酶標儀（美國賽默飛）、分光光度計（上海尤尼柯）。高脂飼料（50%脂肪供能）購自北京博泰宏達生物技術有限公司，具體成份（質量百分比，gm%）為：蛋白質24.2%、碳水化合物40.1%、脂肪27.4%、以及相應維生素和微量元素等，總熱量比為4.7 kcal/gm。本研究經昆明市第三人民醫院倫理委員會審查批準（倫理批號：KSLL20230320005），相關動物實驗使用云南貝斯泰生物科技有限公司的實驗平臺進行（倫理批號：BST-RAT-20221230-1）。

1.2 實驗動物分組與干預正常對照組：8 只。僅普通飲食喂養，不予其他任何處理。另外36 只大鼠給予高脂飼料喂養8 周后，隨機挑選4 只用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死，取肝組織用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肝細胞脂肪變及炎癥損傷情況，從而確定NASH 模型制備是否成功，與國內外專家建模及評估方式一致［9-10］。最終獲得NASH 的大鼠模型32 只，隨機分為4 組，每組8 只。具體如下：（1）模型對照組：予等體積生理鹽水腹腔注射作同樣的刺激對照4 周。（2）二甲雙胍陽性對照組：予二甲雙胍250 mg/（kg·d）［11］腹腔注射給藥4 周。（3）龍膽苦甙組：予龍膽苦甙100 mg/（kg·d）腹腔注射給藥4 周。（4）龍膽苦甙+自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）組：予GPS100 mg/（kg·d）+ 3-MA 15mg/（kg·d）腹腔注射給藥4 周。

1.3 實驗樣品獲取完成以上處理后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死大鼠，自腹正中線切口剪開腹腔，繼續向上剪開胸腔后自心尖取血5 mL，1 500 r/min 離心30 min，取上清儲存于-80 ℃冰箱用于化學發光法和酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等的檢測；切取肝組織用生理鹽水沖洗干凈后分為3 塊，1 塊置于多聚甲醛中固定用于HE 染色，1 塊用RNA 保存液浸泡后置于-80 ℃冰箱用于定量實時聚合酶鏈鎖反應（quantitative real time polymerase chain reaction，q-PCR）檢測，1 塊直接凍存于-80 ℃冰箱中用于Western blot 檢測。

1.4 HE 染色肝組織先用4%多聚甲醛固定，然后乙醇脫水，二甲苯透明，隨后制作石蠟塊，最后切片。切片后采用HE，觀察各組大鼠肝組織病理學變化。

1.5 血脂、ALT 及細胞因子水平測定取每個大鼠血清送至昆明醫科大學實驗室，檢測總膽固醇（total cholesterol，CHOL）、甘油三酯（triglyceride，TG）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）水平。ELISA 檢測腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β），具體步驟按照試劑盒的說明。

1.6 q-PCR檢測取肝組織提取總mRNA，檢測總濃度及純度，用1%凝膠電泳確定mRNA 片段完整性，嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書將mRNA 逆轉錄為cDNA。再按SYBR?Premix Ex TaqTM擴增試劑盒說明書進行擴增，配制反應體系于0.2 mL PCR八聯管：cDNA 溶液2 μL、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL、滅菌水8.5 μL、正向引物1 μL（10 μmol/μL）和反向引物1 μL（10 μmol/μL）。采用二步法PCR標準擴增程序：95 ℃ 30s 共1 個循環及95 ℃ 5s、60 ℃ 50s 共40 個循環，每個標本重復3 次。以GAPDH 為內參，用2-△△CQ分析相關基因的mRNA表達情況。引物序列（表1）由北京擎科生物有限公司合成。

表1 擴增蛋白的引物序列Tab.1 Primer sequences for amplifying proteins

1.7 Western blot取80 mg 肝組織裂解研磨后提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取50 μg 蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，蛋白轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，封閉液室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，洗膜3次，每次5 min。使用增強化學發光法（ECL）試劑盒，成像系統曝光，Image lab 5.0 凝膠成像系統軟件進行目標條帶灰度值分析。

1.8 統計學方法所有數據輸入SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett's T3 檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織HE 染色正常對照組肝小葉結構正常，未見脂肪變及炎癥損傷；模型對照組肝小葉結構紊亂，肝細胞索消失，出現嚴重的大泡小泡混合型肝脂肪變性，可見炎細胞聚集及點片狀壞死；龍膽苦甙組、二甲雙胍陽性對照組肝脂肪變及炎癥損傷均有所減輕，偶可見點狀壞死，未見片狀壞死形成；龍膽苦甙+3MA 組肝脂肪變和炎癥損傷較龍膽苦甙組明顯加重，肝小葉結構紊亂，壞死增多。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色圖片（Bar=50 μm）Fig.1 HE staining images of liver tissue of rats in each group（Bar=50 μm）

2.2 各組大鼠血清ALT 及血脂（CHOL、TG）水平模型對照組ALT、CHOL、TG 水平較正常對照組升高，龍膽苦甙組及二甲雙胍陽性對照組在一定程度上得到逆轉，而龍膽苦甙+3-MA 組的ALT、CHOL、TG 水平又較龍膽苦甙組升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清ALT、CHOL、TG 水平Tab.2 Serum ALT，CHOL，and TG levels of rats in each group ±s

表2 各組大鼠血清ALT、CHOL、TG 水平Tab.2 Serum ALT，CHOL，and TG levels of rats in each group ±s

注：與正常對照組比較，aP ＜ 0.05；與模型對照組比較，bP ＜ 0.05；與龍膽苦甙組比較，cP ＜ 0.05

組別正常對照組模型對照組龍膽苦甙組龍膽苦甙+3-MA組二甲雙胍陽性對照組F值P值TG（mg/mL）0.505 2 ± 0.004 2 0.617 3 ± 0.002 0a 0.503 9 ± 0.002 5b 0.586 2 ± 0.003 0c 0.513 8 ± 0.003 1b 15.852＜ 0.05 ALT（U/L）37.43 ± 0.27 67.44 ± 0.24a 36.37 ± 0.20b 60.37 ± 0.22c 35.57 ± 0.26b 16.018＜ 0.05 CHOL（μmol/mL）0.543 9 ± 0.003 1 0.754 1 ± 0.002 1a 0.555 3 ± 0.001 2b 0.694 0 ± 0.002 2c 0.547 2 ± 0.002 0b 17.965＜ 0.05

2.3 各組大鼠血清炎癥因子（IL-1β、TNF-α）水平模型對照組IL-1β、TNF-α 水平較正常對照組升高，龍膽苦甙組及二甲雙胍陽性對照組中得到逆轉，而龍膽苦甙+3-MA 組又高于龍膽苦甙組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α 水平Tab.3 Serum IL-1 of rats in each group β，TNF-α level ± s，pg/mL

表3 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α 水平Tab.3 Serum IL-1 of rats in each group β，TNF-α level ± s，pg/mL

注：與正常對照組比較，aP ＜ 0.05；與模型對照組比較，bP ＜ 0.05；與龍膽苦甙組比較，cP ＜ 0.05

TNF-α 49.52 ± 0.32 68.46 ± 0.30a 49.47 ± 0.26b 57.41 ± 0.37c 50.63 ± 0.34b 15.179＜ 0.05組別正常對照組模型對照組龍膽苦苷組龍膽苦苷+3-MA組二甲雙胍陽性對照組F值P值IL-1β 74.45 ± 0.20 97.57 ± 0.30a 72.59 ± 0.32b 86.49 ± 0.28c 71.63 ± 0.33b 16.127＜ 0.05

2.4 各組大鼠肝組織LC3Ⅱ mRNA 表達及與LC3Ⅰ的比值模型對照組大鼠肝組織的LC3ⅡmRNA 表達較正常對照組下調，龍膽苦甙組和二甲雙胍陽性對照組得到逆轉，而龍膽苦甙+3-MA 組的LC3Ⅱ mRNA 又轉為表達下調，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖2A。

2.5 各組大鼠肝組織LC3Ⅱ的蛋白質表達及與LC3Ⅰ的比值進一步采用Western blot 檢測大鼠肝組織中LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的蛋白質表達，結果顯示（圖3），LC3Ⅱ的蛋白質與mRNA 的表達模式一致，即：模型對照組LC3Ⅱ的蛋白質表達較正常對照組下調，龍膽苦甙組和二甲雙胍陽性對照組出現逆轉，而龍膽苦甙+3-MA 組又轉為下調，差異有統計學意義（均P＜ 0.05）。見圖3A。

2.6 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的mRNA 比值及蛋白質表達量比值的變化情況與LC3Ⅱ的mRNA 和蛋白質表達模式一致，模型對照組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的mRNA比值和蛋白質表達量比值均較正常對照組低，龍膽苦甙組和二甲雙胍陽性對照組得到逆轉，而龍膽苦甙+3-MA 組又轉為降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖2B 和圖3B。

圖2 大鼠肝組織LC3Ⅱ的mRNA 表達情況及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA 表達量的比值Fig.2 The mRNA expression of LC3Ⅱ and the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA expression in rat liver tissue

3 討論

NASH 是一種炎癥性肝病，與代謝應激有關，往往伴有脂肪過度堆積。自噬與機體組織的自我防御和細胞的自我修復有關，能夠維持細胞能量平衡，可以調控肝臟脂肪代謝、氧化應激及炎癥反應，研究表明飲食誘導的NAFLD 小鼠模型與肝臟自噬有關，恢復自噬可以緩解肥胖小鼠模型中的肝臟脂肪變性［12］。自噬是一種細胞自我消化過程，涉及溶酶體降解靶細胞成分，如受損的細胞器、未折疊的蛋白質和細胞內病原體。哺乳動物細胞中，自噬相關基因（autophagy-related genes，ATGs）編碼的蛋白質形成的系列復合物在自噬過程中發揮重要作用，主要參與自噬的啟動、自噬泡的形成、延伸及成熟和降解，比如，Atg8-磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）系統在自噬過程中必不可少，如果該系統中蛋白質發生缺失或突變，自噬泡就形成不了，也就不會發生自噬現象［13］。

mTOR 是經典途徑自噬的主要抑制通路之一，在自噬的發生及發展中發揮重要作用，上游蛋白AMPK磷酸化增加可抑制mTOR，進而増強自噬［14］。ULK1 復合物在體內是連接上游營養或能量感受器mTOR 和AMPK 與下游自噬體形成的橋梁。微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain，LC3）是Atg8 的同系物，LC3 蛋白在自噬形成過程中具有重要作用，參與細胞自噬泡的形成，其主要有LC3Ⅰ、LC3Ⅱ兩種形式，其中LC3Ⅱ被定義為自噬的一種表面標記。

HANDA 等［15］在喂養富含ω-6 脂肪酸飲食的小鼠模型中，復制了從NAFLD 到NASH 的模型，并用小鼠肝細胞系以及原代肝細胞進行體外機制研究，他們證實了：脂聯素能導致AMPK 活化減少；且較低的酰基輔酶A 羧化酶（ACC）（AMPK 的直接下游靶標）也能活化AMPK 的上游蛋白激酶之一的肝激酶B1（LKB1）。且有研究顯示［16］，樺木酸通過調控AMPK-mTOR-SREBP 信號通路抑制SREBP1的活性，從而減輕NAFLD，在HepG2 細胞和原代肝細胞中，樺木酸顯著抑制HepG2 細胞中過量的甘油三酯積累，并在小鼠肝臟中通過調控mTOR-S6K通路抑制HFD；大黃素通過調控CaMKK-AMPKmTOR-p70S6K-SREBP1 信號通路有效改善肝臟脂肪變性［17］。總之，細胞自噬功能異常與胰島素抵抗、肝臟細胞脂肪代謝異常及炎癥反應有著密切聯系，且與自噬相關信號通路密切相關，本文通過通過檢測LC3Ⅱ的mRNA 和蛋白質表達來探索LC3Ⅱ和自噬現象在大鼠NASH 中的作用和具體的調控機制。

LC3 是Atg8 同源蛋白質中的明星物質，存在LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種形式，LC3Ⅰ是胞質的，而LC3Ⅱ是膜結合的。LC3 中去除C 端22 個氨基酸形成LC3Ⅰ，然后部分LC3Ⅰ將轉化為LC3Ⅱ。LC3Ⅱ存在于自噬體的內部和外部，突變分析表明，LC3Ⅱ的量與自噬體形成的程度相關［18］，因此，LC3Ⅱ是檢測細胞發生自噬的重要指標。另外，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值一定程度上代表了LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉換過程，在自噬激活中也尤為重要［19］。LC3Ⅱ蛋白質表達情況與NASH 密切相關［20］。朱稀雯等［21］發現，NASH 大鼠肝組織自噬程度減弱，蛋白質合成功能降低。羅莉川等［22］的研究也進一步證實，NASH大鼠肝臟LC3Ⅱ的蛋白質表達明顯下調，這種趨勢逆轉后肝臟炎癥將得到改善。

裂環烯醚萜類化合物可以促進自噬［23］，GPS也屬于一種裂環烯醚萜苷化合物，具有顯著的抗炎保肝作用［24］。本研究中，模型對照組LC3ⅡmRNA、蛋白質、以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值（mRNA和蛋白質）均較正常對照組明顯降低，而給予GPS或二甲雙胍逆轉了這種趨勢后，肝脂肪變或組織炎癥情況得到了改善，而進一步給予自噬抑制劑3-MA 后，LC3Ⅱ mRNA、蛋白質、以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值（mRNA 和蛋白質）又下降，與該研究［25］是一致的，且全身性炎癥或肝組織的局部炎癥狀況、以及肝脂肪變情況均明顯加重。這些結果表明自噬的干預可以調控肝臟炎癥及脂肪變的情況，且顯示GPS 可以調控LC3Ⅱ水平。

炎癥因子IL-1β 和TNF-α 在NASH 的發生發展中是十分重要的，參與了單純性肝脂肪變進展為NASH、以及NASH 進展為肝硬化或HCC 的過程［26］，可作為評價NASH 病情嚴重程度的重要指標之一。另外，自噬功能障礙又可導致NLRP3 炎癥小體過度激活，促進炎癥性疾病進展［27］。有研究［28］表明，GPS 衍生物可下調炎癥因子發揮抗炎活性，且有研究［29］表明其可以起明顯的抗炎保肝作用。本研究中，GPS 降低了血清ALT、CHOL、TG水平，又降低了炎癥細胞因子IL-1β、TNF-α 的水平，而且這種治療作用與LC3Ⅱ表達情況和自噬受到調控是密切相關的。進一步說明調控自噬的確是治療NASH 的重要手段之一，且GPS 是通過調控LC3Ⅱ的表達促進自噬實現對NASH 的治療作用的。

綜上所述，GPS 通過上調LC3Ⅱ mRNA 和蛋白質表達激活細胞自噬，降低血清IL-1β、TNF-α 水平發揮抗炎作用，緩解肝組織炎癥狀況，并減輕肝脂肪變程度。本研究為進一步探索GPS 治療NASH 的作用及機制奠定了科學的理論根據和數據基礎，為制定NASH 的治療策略提供了新思路。但是GPS 是否影響自噬信號通路的其他基因，后續還需進一步研究。

【Author contributions】DING Jie and LIU Siqi performed the experiments and wrote the article.WANG Lin，WANG Fang，CHANG Guoji，HUA Lijuan and CHEN Huayi performed the experiments.LI Shenghao and WANG Qingqing revised the article.LI Shenghao，WANG Qingqing，WANG Yiying and SHI Chenghong designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.