過氧化物酶體增殖物激活受體-γ對P.acnes誘導的人角質形成細胞焦亡、增殖及凋亡的影響

易莎 胡楠 李粵 楊林 張玉婷 熊霞 鐘桂書 陳燕

西南醫科大學附屬醫院皮膚科（四川瀘州 646000）

尋常痤瘡（acne vulgaris，AV）是常見的慢性炎癥性皮膚疾病。在我國，此病的發病率約為39.2%，多發生于青少年［1］。皮損主要表形為顏面及胸、背部泛發丘疹膿皰、囊腫結節，部分嚴重者因其損害大、難治愈、易反復、常遺留瘢痕，可引起患者出現多種心理障礙，給患者帶來沉重的心理負擔和精神壓力［2］。痤瘡的發病機制尚未完全明了，主要認為與皮脂腺導管的過度角質化（皮膚角質形成細胞過度增殖）、痤瘡丙酸桿菌（Propionibacteriumacnes，P.acnes）和炎癥、皮脂腺細胞的皮脂分泌失調（皮脂過度分泌或脂質成分改變）等四大因素有關［3-6］。目前多種方法用于痤瘡治療，例如局部治療、口服抗菌藥物及維 A 酸類藥物、激光治療和飲食干預等，但其病情極易反復，長期使用這些方法可能會導致治療抵抗甚至產生其自身無法克服的副作用［7］。因此，進一步研究痤瘡的發病機制對于臨床改善痤瘡治療效果的至關重要。

細胞焦亡是機體重要的免疫反應及一種新型的程序性調控的細胞死亡方式，具有促炎效應，并伴隨細胞膜破裂、細胞崩解。過度的細胞焦亡在導致細胞死亡的同時，釋放炎癥因子，擴大炎癥反應，參與多種疾病的發生［8］。LI 等［9］發現，抑制NLRP3 介導的焦亡作用，可以改善抑郁癥。ZHAO 等［10］證實高血糖相關的巨噬細胞焦亡加速了牙周炎癥的發展。研究表明，痤瘡丙酸桿菌影響的皮膚角質形成細胞，通過產生炎癥反應，參與痤瘡的進程。然而，細胞焦亡是否參與了AV 的發生發展，及其發揮的作用機制尚未明確。

過氧化物酶體增殖物激活受體（eroxisome proliferator-activated receptors，PPAR）主要由：PPARα、PPAR-β/δ以及PPAR-γ構成。研究發現，PPAR-γ及其靶基因在角質形成細胞中表達，發揮保護細胞免受病原菌誘導的炎癥損傷的作用［11］。也有研究報道，PPAR-γ 可通過ROS/TXNIP/NLRP3 通路發揮對肝細胞的抗細胞焦亡保護作用［12］。目前認為，抗細胞焦亡作用尤為關鍵［13］。而PPAR-γ 在痤瘡中是否通過影響P.acnes誘導的細胞焦亡，從而影響痤瘡毛囊導管結構中重要組成部分-角質形成細胞的增殖和炎癥反應尚未闡明。

本研究中擬檢測PPAR-γ在痤瘡組織中的表達，并使用正常人永生化表皮角質形成細胞系HaCaT作為研究對象，探索PPAR-γ是否可以調節P.acnes誘導的細胞焦亡，細胞增殖和凋亡從而減輕炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 組織樣本本研究工作經過了西南醫科大學附屬醫院倫理委員會的批準；所有參與者都提供了書面的知情同意書。在西南醫科大學附屬醫院皮膚科門診病理檢查中，采集4 例痤瘡背部皮損標本，4 例正常背部皮膚組織作為對照。

1.2 細胞培養正常人永生化表皮角質形成細胞系HaCaT（中國科學院昆明細胞生物所）。培養基含有10%胎牛血清（四季青，Invitrogen 公司），高糖培養基（DMEM，Gibico）和1%青霉素鏈霉素（Invitrogen）。培養于5% CO2，37 ℃細胞培養箱中。

1.3 慢病毒轉染使用重組慢病毒（吉瑪，中國上海），包含PPAR-γ質粒（LV-PPARγ）和陰性對照，轉染HaCaT細胞系過表達PPAR-γ。使用靶向PPAR-γ基因（5'-CTGCGGAGCCCTTTGGTGACTTTATGGACAATCTGCCTGAGGTCTGTCATCTTCT-3'）［14］。轉染前，細胞（2×105個細胞/孔）在12 孔板中培養。在達到50%匯合后，用慢病毒以50的感染復數（MOI）轉染HaCaT 細胞。在含有1 μg/mL 嘌呤霉素（Invivogen）的培養基中選擇穩定轉染的細胞。通過Western blot 分析確定基因的過表達效率。

1.4 分組和處理使用或不使用1×107CFU/mLP.acnes分別處理HaCaT 細胞12、24、48、72 h 后，檢測HaCaT細胞中的IL-1β和IL-18水平。分別使用（P.acnes+LV-PPARγ 組）和（P.acnes+LV-PPARγ-NC組）轉染HaCaT細胞48 h，再使用1×107CFU/mLP.acnes處理24 h 后，進行后續的實驗。

1.5 ELISA法檢測IL-1β、IL-18使用ELISA試劑盒（R＆D Systems 公司）對HaCaT 細胞上清液炎性因子IL-1β和IL-18 水平進行檢測，將細胞上清液稀釋到100 μL（1∶20），步驟嚴格按照說明書進行操作，使用酶標儀（Bio-Rad，Hercules）在450 nm 處讀取吸光度值。

1.6 EdU 細胞增殖檢測使用EdU 細胞增殖檢測試劑盒（索萊寶，中國上海）來檢測細胞增殖情況，步驟均嚴格按說明書操作。染色完成后，立即在熒光顯微鏡下進行觀測并拍照。

1.7 Western blot檢測使用適量含PMSF的RIPA裂解液（PMSF+RIPA 按1∶100 混合）裂解細胞并取出各組細胞提取細胞總蛋白，BCA 蛋白試劑盒（碧云天，中國江蘇）定量檢測蛋白質。等量蛋白用經8%、10%和12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺膠電泳分離，然后將蛋白轉移至聚到偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，MA，USA）上。與一抗NLRP3（1∶1 000），Caspase-1（1∶1 000），PPAR-γ（1∶1 000），GSDMD（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）等，4 ℃過夜；洗滌后二抗室溫孵育2 h，使用超敏ECL 化學發光試劑盒檢測蛋白質條帶，并使用Fusion 軟件分析結果。

1.8 免疫組織化學（IHC）痤瘡組織樣本用福爾馬林固定，石蠟包埋，切片成4 μm。切片與PPAR-γ一抗（1∶250）和二抗一起溫育。在光學顯微鏡下觀察結果。

1.9 統計學方法每種實驗至少重復3次。所有計量數據使用表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和q檢驗。采用GraphPad Software 8.0 進行統計學分析。以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PPAR-γ 在痤瘡組織樣本中表達明顯降低采用IHC方法檢測PPAR-γ在痤瘡及正常皮膚組織中的表達水平，結果顯示：PPAR-γ主要在表皮基底層和棘層表達；與正常皮膚組織相比，痤瘡皮膚組織中PPAR-γ 表達明顯下調，差異具有統計學意義（P＜ 0.05）（圖1）。

圖1 PPAR-γ 在痤瘡組織中表達下調Fig.1 PPAR-γ expression was decreased in acne

2.2 P.acnes 可誘導人角質形成細胞產生細胞焦亡效應ELISA 和Western blot 結果顯示：IL-1β 和IL-18 水平顯著升高，且呈時間-依賴方式升高（t=4.957，4.72；P＜ 0.01）。與對照組相比，P.acnes明顯促進了焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1 和GSDMD表達。這表明P.acnes可誘導人角質形成細胞產生細胞焦亡，表現為胞內IL-1β 和IL-18，及細胞焦亡相關蛋白表達水平升高。

2.3 PPAR-γ 過表達細胞系檢測本研究使用慢病毒LV-PPARγ 轉染HaCaT 細胞過表達PPAR-γ，并采用Western blot 驗證了過表達效率，見圖3。

2.4 過表達PPAR-γ可抑制P.acnes誘導的細胞焦亡相關炎癥因子水平ELISA 檢測結果表明，對比未處理組，P.acnes組與LV-PPARγ-NC 組細胞均產生高水平的IL-1β和IL-18（t=5.26，7.23；P＜ 0.05）。然而，與P.acnes組和P.acnes+LV-PPARγ 組對比，P.acnes+ LV-PPARγ 組PPAR-γ 表達明顯上調并且使IL-1β和IL-18水平明顯減少。提示，上調PPAR-γ可抑制P.acnes誘導的炎癥因子水平，保護角質形成細胞免受細胞焦亡損傷。

圖2 體外人角質形成細胞中P.acnes 誘導的細胞焦亡Fig.2 P.acnes induced cell pyroptosis in human keratinocytes vitro

圖3 PPAR-γ 蛋白表達水平檢測結果Fig.3 Detection Results of PPAR-γ Protein Expression Level

圖4 過表達PPAR-γ 抑制P.acnes 誘導的人角質形成細胞焦亡相關炎癥因子水平Fig.4 The upregulation of the PPAR-γ inhibited P.acnes-induced pyroptotic-related inflammatory factors in human keratinocytes

2.5 過表達PPAR-γ 可抑制P.acnes 誘導的細胞焦亡相關蛋白的表達HaCaT轉染LV-PPARγ過表達PPAR-γ，Western blot 檢測發現，P.acnes明顯降低了PPARγ 蛋白水平，促進了Caspase-1；GSDMD表達，見圖5。在相同條件下，P.acnes+ LV-PPARγ組與P.acnes組比較，NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的蛋白質水平（t=6.27，6.43，7.15；P＜ 0.05）均明顯減低。綜上，上調人角質形成細胞中PPAR-γ 表達可降低P.acnes誘導細胞焦亡相關基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的表達水平。

圖5 Western blot 檢測P.acnes 誘導條件下過表達PPAR-γ HaCaT 后人角質形成細胞焦亡相關蛋白的變化Fig.5 The changes of pyroptotic-related proteins of human keratinocytes with PPAR-γ upregulation under P.acnes treatment detected by Western blot

2.6 過表達PPAR-γ可促進P.acnes誘導條件下人角質形成細胞的增殖能力EdU結果顯示：P.acnes組HaCaT 細胞的增殖能力明顯降低；與P.acnes組對比，P.acnes+ LV-PPARγ 組中檢測到較高的細胞增殖水平，見圖6。提示，上調PPAR-γ 可促進P.acnes誘導條件下人角質形成細胞的增殖。

圖6 P.acnes 誘導條件下過表達PPAR-γ 后對HaCaT 細胞增殖能力的影響Fig.6 Effect of PPAR-γ upregulation on proliferation of HaCaT cells under P.acnes treatment

2.7 過表達PPAR-γ 可抑制P.acnes 誘導的細胞凋亡EdU 結果顯示：P.acnes組HaCaT 細胞凋亡明顯增加；與P.acnes組對比，P.acnes+ LV-PPARγ組中檢測到較少的細胞發生凋亡，見圖7。提示，上調PPAR-γ 可抑制P.acnes誘導下人角質形成細胞的凋亡。

圖7 P.acnes 誘導下過表達PPAR-γ 后對HaCaT 細胞凋亡的影響Fig.7 Effect of PPAR-γ upregulation on the apoptosis of HaCaT cells under P.acnes treatment

3 討論

痤瘡作為一種常見的累及毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性疾病。炎癥在AV的發病進程中起重要作用，其中，皮膚角質形成細胞（skin keratinocytes）可通過產生異常炎癥反應，參與AV 的進展［15］。為探究P.acnes在人角質形成細胞中引起的細胞焦亡效應，本研究使用1×107CFU/mLP.acnes誘導HaCaT 細胞，結果發現：在HaCaT 細胞中，經P.acnes處理后可顯著刺激IL-1β 和IL-18 生成；且IL-1β 和IL-18 生成呈時間依賴性模式，同時促進了NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 的表達。這表明P.acnes可以誘導細胞焦亡。有研究發現，P.acnes通過誘導人關節炎細胞中NLRP3/Caspase-1 通路產生過量的炎癥因子，在對抗細胞焦亡方面的能力下降［16］。TANG 等［17］發現，P.acnes可通過刺激NLRP3/Caspase-1 細胞焦亡信號通路，可誘導髓核細胞表達NLRP3、IL-1β、caspase-1 和GSDMD 增加，并呈時間和劑量依賴的方式，對IL-1β 和IL-18 的過度表達有明顯的上調作用。這均證明：P.acnes能誘導細胞焦亡。在機制方面，既往研究報道：細胞焦亡過程依賴于Caspase-1，在外界條件的刺激下，Caspase-1 和 NLRP3 可以成為一種聚合物復合物，即炎性小體，也稱為 Caspase-1 依賴性炎性體。當Caspase-1被激活時，一方面可通過切割GSDMD，進一步誘導細胞膜穿孔、破裂，釋放炎癥因子，引起炎癥反應；另一方面，IL-1β 和IL-18 的前體被切割，形成具有活性的IL-1β 和IL-18 分泌到胞外，募集更多的炎癥細胞，從而擴大炎癥反應［18］。同時，在NLRP3 的靶基因中，Caspase-1 是一個主要效應蛋白酶，能夠介導細胞膜離子梯度發生改變，導致細胞膜破裂，釋放炎性因子IL-1β 和IL-18，誘導細胞死亡［19］。上述研究表明，通過細胞焦亡進一步擴大炎癥反應，可加重細胞損傷，導致細胞破壞。因此，P.acnes在人角質形成細胞中可通過誘導細胞焦亡效應，參與痤瘡角質形成細胞破壞的過程。

既往有研究報道［20］，過表達PPAR-γ，可阻斷Wnt/β-catenin 通路，改善大鼠的NP 和神經炎癥。為了進一步探索PPAR-γ 是否參與痤瘡疾病發展及發揮的作用，本研究發現：PPAR-γ 在AV 中表達下調，且過表達PPAR-γ 可以降低與細胞焦亡相關的炎癥因子IL-1β 和IL-18 表達水平，NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的表達也減少。既往有研究報道［21］，肝細胞可通過激活PPAR-γ，減少乳酸脫氫酶（LDH）、IL-1β和IL-18的釋放，抑制Caspase-1、GSDMD 的激活和NLRP3 的NOD 樣受體的表達，來發揮保護肝細胞的作用。因此，PPAR-γ 在痤瘡中，也可能是通過減少焦亡相關炎癥因子IL-1β 和IL-18的釋放，抑制焦亡相關基因Caspase-1、GSDMD和NLRP3，來降低痤瘡的炎癥反應。在抗細胞焦亡的機制研究中，以往研究［12］也報道PPAR-γ 可通過ROS/TXNIP/NLRP3 通路發揮對肝細胞的抗細胞焦亡保護作用。文獻報道，發育期大鼠海馬神經元中miR-223［22］及糖尿病腎病lncRNA H19［23］過表達均可能通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路來減輕相應細胞的焦亡，從而減輕細胞炎癥損傷。進一步說明，PPAR-γ 通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路可減輕細胞焦亡。

在本研究中還發現，P.acnes誘導的HaCaT 細胞過表達PPAR-γ，人角質形成細胞增殖能力增加，細胞凋亡受到抑制。相關研究已證明［24］，通過激活PPAR-γ/RXR-α/Wnt 信號可促進滋養細胞的增殖、遷移和入侵。在心肌及軟骨中激活PPAR-γ可抑制細胞的炎癥，保護細胞免受凋亡［25-26］。因此，在P.acnes誘導的HaCaT 細胞中過表達PPAR-γ，可促進人角質形成細胞增殖，減少細胞凋亡。

綜上所述，本研究證明P.acnes可誘導人角質形成細胞產生細胞焦亡，過表達PPAR-γ 逆轉P.acnes誘導的角質形成細胞焦亡和凋亡，促進細胞增殖，可能與PPAR-γ 介導的細胞焦亡相關基因，如NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 等的表達發生改變相關。這有助于對痤瘡炎癥發生及調節機制的理解，且使用任何方法激活PPAR-γ 通路或細胞焦亡相關基因可能是減輕痤瘡患者角質形成細胞炎癥損傷的有效策略。PPAR-γ 介導的細胞焦亡在痤瘡的發病機制中的研究是本文創新之處。由于本研究目前僅在體外利用HaCaT 細胞系進行研究，有必要進行動物體內的研究，以確定本研究的發現與正常角質形成細胞進行比較。

【Author contributions】CHEN Yan performed the experiments and wrote the article.YI Sha，ZHANG Yuting，HU Nan，LI Yue and YANG Lin performed the experiments.YI Sha revised the article.CHEN Yan and ZHONG Guishu designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.