基于Hippo/YAP信號(hào)通路探討穿心蓮內(nèi)酯抗三陰性乳腺癌的作用機(jī)制

黃翠霞 張雅倩 楊愛萍 劉芮含秋 路艷

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究中心（廣州 510006）

乳腺癌是日漸年輕化的惡性腫瘤之一，已成為女性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因［1］。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是具有高轉(zhuǎn)移率、高復(fù)發(fā)率、預(yù)后差、低生存率等特點(diǎn)的乳腺癌亞型。因TNBC 的孕酮受體、雌激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體-2 表達(dá)均為陰性，臨床上常用的內(nèi)分泌治療和靶向治療均不適用于TNBC 患者［2-3］。因此，探索新的治療藥物及尋找新的治療靶點(diǎn)是攻破該疾病的關(guān)鍵。研究表明，YAP 蛋白（yesassociatedprotein，YAP）在乳腺癌的增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal cell transition，EMT）和干細(xì)胞特性等方面扮演著重要角色［4-5］。因此，YAP 可能是乳腺癌防治的潛在靶點(diǎn)。

穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，Andro）是中藥穿心蓮的主要成分，其可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)EMT 進(jìn)程。據(jù)報(bào)道，Andro 可通過多通路多靶點(diǎn)的途徑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，阻斷細(xì)胞周期，在乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等腫瘤中具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性［6-8］，但Andro 基于Hippo/YAP 信號(hào)通路抑制TNBC 細(xì)胞生長(zhǎng)和干細(xì)胞特性方面的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，研究Andro 抑制TNBC 細(xì)胞的生長(zhǎng)和干細(xì)胞特性的作用，探索Andro 在Hippo/YAP 信號(hào)通路上的作用機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和動(dòng)物乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和4T1（中科院上海細(xì)胞庫(kù)）。7～8周齡，體質(zhì)量18～23 g，BALB/c 雌性小鼠15 只（廣州銳格生物科技有限公司），動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44827200000914。研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：20210929001）。

1.1.2 藥物及試劑Andro（上海陶術(shù)生物技術(shù)有限公司），批號(hào)：5508-58-7。DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM/F12 培養(yǎng)基、B-27 Supplement（50×）、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、0.25%胰酶（美國(guó)Gibco 公司）；蛋白marker（北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司）；蛋白定量試劑盒、CD24-PE、CD44-FITC 抗體（賽默飛世爾科技公司）；顯影液（美國(guó)Affinity 公司）；FITC/PI 凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)公司）；二抗兔和一抗（YAP、ANKRD1、p-YAP、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、NESTING、NANOG 和Gapdh）（武漢愛博泰克生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SRB 法檢測(cè)細(xì)胞活性細(xì)胞接種在96 孔板24 h后；加入含不同濃度Andro的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48 和72 h；固定1 h 后，SRB 溶液室溫染色；再加入10 mmol/L Tris 溶液溶解30 min；最后檢測(cè)各孔光吸收值，計(jì)算各組細(xì)胞的活力。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力用無菌槍頭對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕，將含有不同濃度的Andro 的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，于不同時(shí)間點(diǎn)在倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞劃痕位置進(jìn)行圖像拍攝，計(jì)算劃痕愈合率，劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-72 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD44+/CD24-/low的比例Andro 作用細(xì)胞48 h 后，離心、重懸細(xì)胞，在避光條件下染色，空白組加入1×PBS 溶液4 μL，Control 單染一組、Control 單染二組分別加入CD44－FITC、CD24-PE 各4 μL，Control 雙染組及Andro 組均加入CD44-FITC和CD24-PE 4 μL，冰上避光孵育30 min，洗滌細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)乳腺微球的增殖能力以每孔105個(gè)細(xì)胞接種于極低吸附力6 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，加入含有不同濃度的Andro的干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d，在倒置顯微鏡下觀察干細(xì)胞球形態(tài)并拍攝圖像，計(jì)算各濃度的乳腺微球數(shù)量。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平收集細(xì)胞的總蛋白并進(jìn)行定量分析，各濃度取蛋白20 μg 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳；轉(zhuǎn)膜，封閉；加入相應(yīng)的一抗，于4 ℃冰箱孵育過夜；次日用1×TBST 溶液沖洗后，加入二抗孵育1 h，顯影，用ImageJ 軟件對(duì)相應(yīng)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.6 移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察Andro 對(duì)乳腺腫瘤的影響構(gòu)建4T1 TNBC 模型，并將造模成功小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組及高劑量組，每組5 只小鼠，每組分別予1×PBS 溶液、Andro 5 mg/kg、Andro 10 mg/kg各10 μL，連續(xù)經(jīng)腹腔注射的方式給藥2周后，取出移植瘤，計(jì)算腫瘤體積［（寬2×長(zhǎng)）/2］。

1.2.7 免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)蛋白在腫瘤中的表達(dá)對(duì)切片進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、透膜，添加一抗，并置于4 ℃冰箱孵育過夜；次日將切片復(fù)溫后，添加二抗，孵育30 min；再用DAB 進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，然后用乙醇進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片；顯微鏡觀察并拍片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；以P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Andro 對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖的影響由圖1 可知，隨著Andro 干預(yù)濃度增加與培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞的活性隨之降低。Andro干預(yù)MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞72 h 后的IC50值分別為12.63 μmol/L 和11.54 μmol/L，并由此選擇5、10和20 μmol/L 濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 Andro 對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Andro inhibited the proliferation on TNBC cells

2.2 Andro 對(duì)TNBC 細(xì)胞遷移的影響由圖2 可知，經(jīng)Andro 干預(yù)后的MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞劃痕的愈合速度均有所降低，且呈劑量依賴性。各濃度組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜ 0.001）。

2.3 Andro 對(duì)TNBC 干細(xì)胞特性的影響由圖3A-B 可知，Andro 可降低MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞的干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44+/CD24-/low的比例，且呈劑量依賴性。由圖3C-D 可知，經(jīng)Andro 干預(yù)后的MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞的干細(xì)胞球的體積減小和數(shù)量減少，且呈濃度依賴性。同時(shí)，Andro 以濃度依賴性的方式降低了的MDA-MB-231 和4T1細(xì)胞中NANOG 和NESTING 蛋白的表達(dá)水平，各Andro 濃度組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，P＜ 0.01，P＜ 0.001），結(jié)果見圖3E。

2.4 Andro 對(duì)TNBC 細(xì)胞EMT 的影響經(jīng)Andro干預(yù)后的MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)上升，而Vimentin、N-cadherin 和Fibronectin蛋白表達(dá)下降，且呈濃度依賴性，見圖4。

2.5 Andro 對(duì)TNBC 細(xì)胞中YAP、ANKRD1 和p-YAP 蛋白的影響由圖5 可知，Andro 以濃度依賴性的方式下調(diào)MDA-MB-231 和4T1 細(xì)胞中YAP 和ANKRD1 蛋白表達(dá)水平，上調(diào)p-YAP 蛋白表達(dá)水平。

2.6 Andro 對(duì)小鼠移植瘤的生長(zhǎng)及腫瘤中YAP 和ANKRD1 蛋白的影響與對(duì)照組相比，經(jīng)Andro處理的小鼠腫瘤體積和質(zhì)量均有所減小，抑瘤率明顯升高（P＜ 0.01），見表1。如圖6所示，對(duì)照組YAP和ANKRD1蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，呈黃褐色顆粒狀染色，而Andro（5、10 mg/kg）組YAP 和ANKRD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)降低，黃褐色顆粒狀染色變淺，兩個(gè)劑量組的陽(yáng)性表達(dá)率與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01，P＜ 0.001），見表2。

表1 Andro 對(duì)小鼠移植瘤生長(zhǎng)情況的影響Tab.1 Effect of Andro on the growth of tumor in mice±s，n=5

表1 Andro 對(duì)小鼠移植瘤生長(zhǎng)情況的影響Tab.1 Effect of Andro on the growth of tumor in mice±s，n=5

注：抑瘤率（%）=（對(duì)照組腫瘤平均重量-Andro各劑量組腫瘤平均重量）/對(duì)照組平均重量×100%。與對(duì)照組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

組別對(duì)照組低劑量組高劑量組抑瘤率（%）/10.26 ± 0.03**30.30 ± 0.04**劑量（mg/kg）0 5 10腫瘤體積（mm3）386.99 ± 2.10 338.57 ± 12.51*283.34 ± 8.45**腫瘤質(zhì)量（g）4.29 ± 0.98 3.85 ± 0.11*2.99 ± 0.41**

圖2 Andro 對(duì)TNBC 細(xì)胞遷移的影響Fig.2 Andro inhibited the migration on TNBC cells

圖3 Andro 對(duì)TNBC 的干細(xì)胞特性的影響Fig.3 Effects of Andro on stem cell properties of TNBC cells

圖4 Andro 對(duì)TNBC 細(xì)胞EMT 的影響Fig.4 Effects of Andro on expression of EMT related protein markers in TNBC cells

圖5 Andro 對(duì)TNBC 細(xì)胞中YAP、ANKRD1 和p-YAP 蛋白的影響Fig.5 Effects of Andro on expression of YAP，ANKRD1 and p-YAP proteins in TNBC cells

3 討論

TNBC 是乳腺癌中致死率較高的亞型［1］，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。研究表明，腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）數(shù)量極少，具有自我更新、多向分化潛能、高致瘤性等特點(diǎn)［3］，是TNBC 增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要機(jī)制。EMT 是TNBC 轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制，在EMT 進(jìn)程中，維持上皮細(xì)胞表型的黏附分子被間質(zhì)細(xì)胞的表型分子所取代，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間的黏附力降低，從而增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，加快腫瘤的進(jìn)展［9］。因此，抑制CSCs 自我更新分化能力和EMT 進(jìn)程是攻破 TNBC 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Andro具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，有文獻(xiàn)報(bào)道［10］，Andro 通過抑制糖酵解，恢復(fù)氧化磷酸化，改善線粒體功能等途徑，發(fā)揮抗乳腺癌小鼠腫瘤的作用。本研究先利用TNBC 細(xì)胞開展體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Andro 各濃度組的細(xì)胞活性和遷移率明顯低于對(duì)照組。同時(shí)，Andro 可降低TNBC 細(xì)胞CD44+/CD24-/low的比例及干細(xì)胞成球能力，且降低了干性標(biāo)志蛋白NANOG 和NESTING 的表達(dá)水平。研究還發(fā)現(xiàn)，Andro 能上調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Vimentin、N-cadherin 和Fibronectin 蛋白表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了在體外Andro 能抑制TNBC 細(xì)胞的增殖、遷移能力、干細(xì)胞特性和EMT進(jìn)程。為了驗(yàn)證Andro 在體內(nèi)也具有抗TNBC 的作用，本研究構(gòu)建了小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，Andro 各劑量組的小鼠腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量明顯低于對(duì)照組，抑瘤率高于對(duì)照組。表明了Andro在體內(nèi)可抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，提高抑瘤率。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Andro 在體內(nèi)外均有抗TNBC的作用。

圖6 Andro 對(duì)腫瘤中YAP 和ANKRD1 蛋白的影響（IHC，×400）Fig.6 Effects of Andro on expression of YAP and ANKRD1proteins of tumor（IHC，×400）

表2 小鼠腫瘤組織中YAP 和ANKRD1 蛋白表達(dá)量Tab.2 The expression of YAP and ANKRD1 protein of tumor in mice±s，n=4

表2 小鼠腫瘤組織中YAP 和ANKRD1 蛋白表達(dá)量Tab.2 The expression of YAP and ANKRD1 protein of tumor in mice±s，n=4

注：與對(duì)照組相比，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001

組別對(duì)照組低劑量組高劑量組ANKRD1 125.87 ± 3.23 79.55 ± 1.03**43.77 ± 2.76***YAP 130.04 ± 4.14 102.44 ± 2.25**69.77 ± 3.28***

Hippo信號(hào)通路是一條由激酶鏈和YAP及TAZ兩個(gè)效應(yīng)因子組成的信號(hào)通路［11］，在調(diào)控器官大小、組織生長(zhǎng)、干細(xì)胞自我更新分化和腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程中發(fā)揮著重要作用［13-14］。當(dāng)Hippo 信號(hào)通路被激活后，上游激酶發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起下游YAP 磷酸化，被磷酸化的YAP 與14-3-3 蛋白結(jié)合并被滯留在細(xì)胞質(zhì)中而無法進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子（如TEADs）結(jié)合，使其失去轉(zhuǎn)錄功能。而非磷酸化的YAP 與細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，才能發(fā)揮調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄的功能，從而影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，如促進(jìn)細(xì)胞增殖、干細(xì)胞自我更新分化和抑制細(xì)胞凋亡等過程［4，12］。已有研究表明［14-16］，YAP 在乳腺癌、卵巢癌和食管癌等多種腫瘤中YAP 呈高表達(dá)，其過度激活在腫瘤干細(xì)胞自我更新和分化能力、EMT 等過程中具有重要調(diào)控作用［17-19］。YANG 等［20］發(fā)現(xiàn)氯丙嗪可通過促進(jìn)YAP的蛋白酶體降解而抑制YAP 的表達(dá)，從而抑制乳腺癌干細(xì)胞成球能力和ALDH 的活性，從而發(fā)揮抗乳腺癌干細(xì)胞的能力。有研究表明，通過抑制YAP/TAZ 的表達(dá)和核定位，從而抑制乳腺癌細(xì)胞SKBR3 的增殖和EMT 進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［21］。本研究結(jié)果顯示，Andro 能有效促進(jìn)YAP 磷酸化，降低TNBC 細(xì)胞中的YAP 及下游靶基因ANKRD1 蛋白表達(dá)，且與小鼠移植瘤的免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由此可知，Andro 在體內(nèi)外均可降低YAP 和ANKRD1 蛋白的表達(dá)。ANKRD1 基因是錨蛋白重復(fù)序列家族成員，也是YAP 的靶基因，其參與炎癥、惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程［22-24］。有研究表明［24］，通過下調(diào)ANKRD1 蛋白的表達(dá)水平，可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力；上調(diào)ANKRD1 的表達(dá)，可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT 進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖與遷移［25］。因此，Andro 誘導(dǎo)YAP 磷酸化，下調(diào)YAP 和ANKRD1 蛋白的表達(dá)水平，可能是Andro 抑制TNBC 細(xì)胞的增殖、遷移能力、干細(xì)胞特性和EMT進(jìn)程的作用機(jī)制。

綜上所述，Andro發(fā)揮抗TNBC的作用可能是通過介導(dǎo)Hippo/YAP 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。由此，Andro可能是對(duì)高YAP 活性的乳腺癌患者治療有效的潛在藥物。但本研究?jī)H對(duì)下游基因進(jìn)行研究，因此在Hippo 信號(hào)通路的上游激酶及YAP 與TEADs之間的聯(lián)系等方面有待進(jìn)一步深入探討。

【Author contributions】HUANG Cuixia performed the experiments and wrote the article.ZHANG YAqian，YANG Aiping，LIU Ruihanqiu performed data collection and statistical analysis.LU Yan designed the study and reviewed.the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted