miR-141-3p靶向CDC25B調節VEGF通路對三陰性乳腺癌血管生成的機制研究

陳燕枝

(江西醫學高等專科學校病理學與病理生理學教研室, 江西 上饒 333400)

三陰性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)是一種不表達雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(HER-2)的特定乳腺癌亞型,由于具有高異質性,侵襲性并缺乏治療選擇,TNBC患者的生存時間更短,5年生存率比雌激素受體陽性乳腺癌低8～16%,且預后較差[1]。因此,需要尋找新的分子靶點進行干預治療TNBC。近年來,研究發現腫瘤血管生成在腫瘤發生、發展中發揮重要作用,腫瘤的生長和轉移在很大程度上依賴于血管生成[2]。腫瘤血管生成是指從現有的血管系統中形成新血管,而這一過程可為增殖和轉移的癌細胞提供必要的營養和氧氣。血管生成抑制劑已成為許多實體瘤的有效治療策略,如抗血管形成藥物bevacizumab已被證實對TNBC治療有效[3]。因此,深入探討TNBC血管生成的分子機制對TNBC的治療具有重要意義。細胞分裂周期25B(cell division cyclin25 B,CDC25B)在許多原發性腫瘤中過度表達,包括乳腺癌[4]、結直腸癌[5]和食管鱗狀細胞癌[6]等。如在子宮內膜癌中,miR-152通過抑制CDC25B的表達,誘導G2/M期阻滯,從而抑制子宮內膜癌細胞的增殖。目前關于CDC25B影響TNBC血管生成的研究尚未有報道,因此,本研究將進一步探究CDC25B對TNBC血管生成的影響及其作用機制。本研究發現CDC25B在TNBC中顯著上調表達并參與調控VEGF通路,沉默CDC25B能夠抑制TNBC血管生成。此外,miR-141-3p靶向負調節CDC25B的表達,進而抑制VEGF通路抑制TNBC血管生成。本文闡明了miR-141-3p/CDC25B/VEGF軸在TNBC血管生成過程中的調控作用及分子機制,為靶向TNBC血管生成提供了潛在的分子靶點。

1 資料與方法

1.1生信分析:從TCGA中下載乳腺癌mRNA表達量數據(Normal:41,Tumor:473),利用'edgeR'包對mRNA進行normal組和tumor組的差異分析(|logFC|>1.5,FDR<0.05)獲得DEmRNA,通過文獻引證確定研究的目標基因CDC25B。利用starbase數據庫預測乳腺癌中目標基因上游的調控miRNA,通過Pearson相關性確定研究對象為miR-141-3p。利用GSEA軟件對CDC25B基因進行通路富集分析。

1.2細胞培養:從ATCC(美國)購入293T、人乳腺上皮細胞MCF-10A、人TNBC細胞系(BT-549、MDA-MB-468、MDA-MB-231)和人臍靜脈內皮細胞HUVEC。上述所有細胞系均在含10% FBS的RPMI-1640培養基中培養,培養環境為37℃,含5%CO2。

1.3細胞轉染:miR-mimic(miR-141-3p mimic)si-CDC25B、oe-CDC25B及其陰性對照mimic-NC、si-NC和oe-NC均購自Ribobio(China)。根據制造商的說明,使用Lipofectamine2000(Invitrogen,USA)將上述載體轉染到TNBC細胞中。

1.4細胞增殖檢測:用Cell Counting Kit-8(CCK-8)進行細胞增殖試驗。將細胞以4×103個細胞的密度接種于96孔培養板中培養24h。分別在0d、1d、2d、3d和4d后,將CCK-8溶液添加到細胞中,并在450nm處對每個孔中細胞的吸光度進行測定。

1.5HUVEC血管形成試驗:將50μL未稀釋的基質凝膠(Corning,USA)加入96孔板中培養30min。然后,將1×104個HUVEC細胞添加到Matrigel預涂層的96孔板中,并與來自轉染成功的TNBC細胞的條件培養基(CM)孵育。6h后對小管進行觀察并拍照。

1.6qRT-PCR:通過TRIZOL試劑(Invitrogen,USA)從細胞系中提取總RNA,用MultiScribeReverse Transcriptase(Thermo Fisher Scientific,USA)進行cDNA合成,并使用SYBR Green Real-Time PCR assay kit (Thermo Fisher Scientific,USA)進行擴增和檢測,qRT-PCR在ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems,USA)上進行。U6和β-actin分別作為miR-141-3p和CDC25B的內參基因,通過2-ΔΔCT計算目的基因的相對表達水平,引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7Western blot實驗:從TNBC細胞中提取的總蛋白樣品在SDS-PAGE中進行電泳分離,隨后電轉移到PVDF膜上。然后用5%脫脂牛奶封閉細胞1h,并用一抗在4℃孵育過夜,然后用辣根過氧化物酶偶聯的二抗孵育2h。通過ECL試劑盒(Pierce Biotechnology,USA)檢測蛋白條帶,并在化學發光成像系統上成像。本文所用的一抗包括:兔抗β-actin,兔抗CDC25B,兔抗VEGFA,兔抗VEGFR-2和兔抗VEGFR-3。

1.8雙熒光素酶報告分析實驗:構建了包含miR-141-3p結合位點的CDC25B野生型(WT)或突變型(MUT)雙螢光素酶報告質粒。將上述質粒與miR-mimic和mimic-NC共轉染到293T細胞中。培養48h后,用雙熒光素酶報告系統(Promega,USA)測定熒光素酶的活性。

1.9數據分析:統計分析使用GraphPad Prism 8.0版本進行。所有數據均表示為平均值±標準差。組間差異的P值由兩組比較的Student's t檢驗或多組比較的單因素方差分析確定。P<0.05被認為具有統計學意義。

2 結 果

2.1CDC25B在TNBC中上調表達:首先,基于TCGA數據庫發現CDC25B在TNBC腫瘤組織中顯著上調(圖1A)。隨后,通過qRT-PCR檢測了TNBC細胞系(BT-549、MDA-MB-468、MDA-MB-231)中CDC25B的表達水平,發現CDC25B在TNBC細胞系中的表達水平相較于人正常乳腺癌上皮細胞系(MCF-10A)顯著升高(圖1B-C)。進一步通過GSEA分析發現CDC25B顯著調控VEGF SIGNALING PATHWAY通路(圖1D)。

圖1 CDC25B在TNBC中上調表達

2.2CDC25B通過調控VEGF通路促進TNBC血管生成:為了闡明CDC25B在TNBC血管生成中的潛在作用,將si-NC/si-CDC25B和oe-NC/oe-CDC25B分別轉染到MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞進行后續實驗。本研究發現,相較于si-NC組,si-CDC25B組細胞中的CDC25B的表達顯著降低(圖2A,E),而相較于oe-NC組,oe-CDC25B組細胞中的CDC25B的表達顯著升高。CCK-8檢測結果顯示,與對照組相比,si-CDC25B組細胞的增殖水平明顯下降,而oe-CDC25B組細胞的增殖水平明顯上升(圖2B)。為了確定CDC25B是否參與TNBC血管生成,我們將HUVEC細胞與轉染si-NC/si-CDC25B和oe-NC/oe-CDC25B的TNBC細胞條件培養基共孵育。血管形成實驗結果表明,CDC25B的沉默表達顯著抑制了HUVEC細胞的血管形成,而過表達CDC25B則明顯促進了HUVEC細胞的血管形成(圖2C-D)。與此同時,沉默CDC25B明顯抑制了血管生成因子VEGFA、VEGFR-2和VEGFR-3的表達,而過表達CDC25B得到相反的結果(圖2E)。上述研究結果表明CDC25B可以在TNBC進展過程中促進HUVEC細胞的血管生成。

圖2 CDC25B通過調控VEGF通路促進TNBC血管生成

2.3miR-141-3p靶向下調CDC25B的表達:為了探索CDC25B在TNBC中促血管生成功能的分子機制,我們利用starbase數據庫尋找CDC25B的上游潛在調控miRNA,與差異上調基因取交集共得到3個差異的miRNA(圖3A)。利用Pearson相關性分析發現CDC25B與miR-141-3p的顯著負相關(圖3B),且miR-141-3p在TNBC腫瘤組織中下調表達(圖3C)。此外,生信數據庫預測到miR-141-3p與CDC25B存在潛在的結合位點(圖3D)。為進一步驗證生信的結果,qRT-PCR分析結果顯示miR-141-3p在TNBC細胞中下調表達(圖3E)。隨后,雙熒光素酶報告分析發現,miR-mimic可以降低293T細胞中野生型CDC25B的熒光素酶活性,(圖3F)。此外,過表達miR-141-3p后CDC25B的mRNA和蛋白表達顯著下調(圖3G-H)。上述結果表明,miR-141-3p靶向下調CDC25B的表達。

圖3 miR-141-3p靶向下調CDC25B的表達

2.4miR-141-3p通過靶向CDC25B調節VEGF通路抑制TNBC血管生成:為了闡明miR-141-3p/CDC25B在TNBC血管生成中的作用,我們設置了回復實驗,將mimic-NC+oe-NC、miR-mimic+oe-NC和 miR-mimic+oe-CDC25B轉染到MDA-MB-231細胞中。我們發現,與mimic-NC+oe-NC組相比,miR-mimic+oe-NC組細胞中CDC25B的表達顯著下調,而miR-mimic+oe-CDC25B組細胞中CDC25B的表達得到部分回復(圖4A,E)。CCK-8分析結果顯示,過表達miR-141-3p顯著抑制MDA-MB-231細胞的增殖能力,而進一步過表達CDC25B逆轉了miR-141-3p對細胞增殖的抑制作用(圖4B)。血管形成實驗結果表明,miR-141-3p過表達顯著抑制了HUVEC細胞的管形成能力,而進一步過表達CDC25B逆轉了這一結果(圖4C-D)。Western blot結果顯示,miR-141-3p過表達顯著下調了VEGFA、VEGFR-2和VEGFR-3的表達,而TmiR-141-3p過表達的同時過表達CDC25B使這些蛋白的表達回復到對照組水平(圖4E)。這些結果表明,miR-141-3p通過靶向CDC25B抑制VEGF通路活性,進而抑制TNBC血管生成。

圖4 miR-141-3p通過靶向CDC25B調節VEGF通路抑制TNBC血管生成

3 討 論

研究表明,腫瘤的生長和轉移在很大程度上依賴于血管生成。腫瘤血管生成是指從現有的血管系統中形成新血管,而這一過程可為增殖和轉移的癌細胞提供必要的營養和氧氣。近年來,腫瘤血管生成過程的研究越來越受到人們的關注,血管生成抑制劑已成為許多實體瘤的有效治療策略[7]。抗血管生成藥物主要是通過阻斷血管內皮生長因子(VEGF)/VEGF受體(VEGFR)信號通路實現破壞血管供應并使腫瘤缺乏營養和氧氣[8]。截至目前,FDA已批準上市多種靶向血管生成信號通路的藥物,并在臨床抗腫瘤治療中顯示出良好的益處[9]。考慮到血管生成對TNBC的發生、進展和預后至關重要,探究參與調節TNBC血管生成的分子機制有助于為開發新型有效的抗血管生成策略提供支持。本研究的結果表明CDC25B在TNBC中具有顯著的促血管生成作用,CDC25B可能是TNBC治療的潛在治療靶點。

CDC25B是G2/M細胞周期進展的關鍵參與者。最近,CDC25B在腫瘤進展中致癌特性被諸多報道。如在頭頸部鱗狀細胞癌中,METTL3增強CDC25B的m6A修飾,促進頭頸部鱗狀細胞癌惡性進展[10]。在TNBC中,microRNA-211靶向負調節CDC25B表達抑制TNBC細胞的生長和遷移[11]。本研究同樣也發現CDC25B在TNBC中顯著高表達,過表達CDC25B可以促進TNBC細胞的增殖。此外,據報道METTL3增強了CDC25B mRNA的m6A修飾,從而保持其穩定性并上調其表達,從而激活細胞周期的G2/M期并促進頭頸部鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成[11]。本研究中,CDC25B高表達富集在VEGF通路上。沉默CDC25B可以降低VEGFA、VEGFR-2和VEGFR-3的表達,進而抑制TNBC中內皮細胞的血管生成能力。在腫瘤中,VEGF與在內皮細胞上表達的VEGFR結合,從而積極調節血管生成過程[12]。因此,目前靶向VEGF信號通路的療法被認為在阻斷癌癥血管生成中是極其重要的。這些結果表明CDC25B是調節VEGF通路的關鍵介質,提示其可能是阻斷腫瘤血管生成的潛在治療靶點。

為進一步明確CDC25B在TMBC血管生成中的分子作用機制。通過生信分析發現CDC25B存在上游調控分子miR-141-3p,miR-141-3p可以靶向抑制CDC2B的表達。miR-141-3p已被報道與多種癌癥的惡性進展有關,在乳腺癌和乳頭狀甲狀腺癌中作為抑癌基因發揮作用。一項研究報道,miR-141-3p通過靶向TRAF5抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究中,miR-141-3p在TNBC中低表達,過表達miR-141-3p可以抑制TNBC細胞增殖,這與Li W等的研究結果一致。除此之外,本研究還發現miR-141-3p可以靶向CDC25B抑制VEGF通路的活性和降低VEGFA、VEGFR2和VEGFR-3的表達,進而抑制TNBC血管生成。總之,這項研究首次揭示了miR-141-3p/CDC25B軸在TNBC血管血管生成中功能及其調控機制,為TNBC抗血管生成療法提供了潛在的靶點。

綜上所述,本研究證實CDC25B在TNBC中顯著高表達,且通過介導VEGF信號通路參與調節TNBC血管生成。從機制上講,CDC25B受到上游調控分子miR-141-3p的調控,miR-141-3p靶向抑制CDC25B的表達并通過抑制VEGF途徑抑制TNBC血管生成。盡管本研究通過體外實驗揭示了miR-141-3p/CDC25B/VEGF通路抑制TNBC血管生成的機制,但仍存在不足之處,未來尚需進一步通過開展動物實驗和臨床試驗在體內驗證本研究結果的準確性。此外,該通路是否參與調控TNBC其他惡性過程有待進一步探究。總之,本研究結果表明miR-141-3p/CDC25B/VEGF通路是抑制TNBC血管生成的關鍵調控機制,這可能為TNBC抗血管生成治療提供新途徑。