人鼻病毒3C蛋白酶發(fā)酵工藝研究

曾維星

(湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院,湖北 武漢 430068)

人鼻病毒3C蛋白酶是一種切割小RNA病毒科非結構蛋白的關鍵酶,可識別含有Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro序列的蛋白,并切割Gln與Gly之間的酰胺鍵,酶切適宜溫度范圍為4 ℃至30 ℃[1],對于溫度敏感的底物較為友好,作為一種基因工程方面的工具酶,其作用為去除融合蛋白的標簽[2]。3C 蛋白酶作為mRNA的體外合成重要酶原料,對其展開發(fā)酵工藝研究,具有一定的社會價值,描述了搖瓶培養(yǎng)產3C 蛋白酶的重組大腸桿菌,確定了最優(yōu)培養(yǎng)基,接著通過發(fā)酵罐放大培養(yǎng)摸索,完成菌株穩(wěn)定表達3C蛋白酶的發(fā)酵工藝,為該酶的工業(yè)化放大生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗所用的重組菌株為本實驗室保存。

1.2 試劑及設備

酵母粉及蛋白胨購買于安琪酵母股份有限公司、磷酸二氫鉀、甘油、硫酸亞鐵、硫酸鋅等購買于國藥集團化學試劑有限公司,垂直流潔凈工作臺為Opticlean1300型號,超微量紫外分光光度計為NanoDrop One型號,立式恒溫振蕩器為IS-RDV1型號,7 L發(fā)酵罐為BIOTECH-7JG-7000A型號,無油靜音空氣壓縮機為TE7502型號,低溫保存箱為DW-30L818P型號,pH計為德國梅特勒-托利多FE28-Standard型號,高壓均質機為AH-NANO型號。

1.3 試驗過程

1.3.1 培養(yǎng)基的尋優(yōu)篩選

1.3.1.1 Plackett-Burman試驗

大腸桿菌生長所需要的營養(yǎng)包括六大類物質,需要有合適的碳源、氮源、微量元素的提供,其中微量元素需求量少,但對微生物的生長起著重要的促進作用[3],通過單因素試驗,初步確定將酵母粉、蛋白胨、甘油、硫酸鋅、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、種齡、接種量為初始培養(yǎng)物料及條件作為培養(yǎng)的重點考察項目,見表1。根據表達常規(guī)所需的濃度設定高低水平值。選擇n=12的試驗組,并將上述的8個因素作為分析對象,使用Minitab 19 軟件設計Plackett-Burman試驗,按500 mL 三角搖瓶裝液150 mL 培養(yǎng)液規(guī)模實施試驗,取菌體生長4 h的OD600,實施完畢后,匯總數據至Minitab 19的新建列中分析因子設計。

表1 Plackett-Burman試驗預定因素的取值表

1.3.1.2 最陡爬坡試驗

按設計進行Plackett-Burman試驗后,將結果錄入Minitab 19 軟件的新建列中,進行DOE項下的因素分析,可得到方差分析數據表,根據各項因素的顯著性程度判斷該因素是否為影響培養(yǎng)OD600的顯著因素,T值表示接受原假設的置信區(qū)間,P值為除T值置信區(qū)間以外的區(qū)域,P值越小,說明統計學上,一般以P值<0.05作為因素顯著的判斷點,確定出酵母粉、蛋白胨、甘油三個因素具有顯著因素,并對顯著因素設置0.5～1.0的步長,且均為正效應因素,實施最陡爬坡實驗。選取各因素在Plackett-Burman試驗設計中靠近上限的值為爬坡起點值。

1.3.1.3 響應面試驗

最陡爬坡試驗確定中心點后,以中心點位置繼續(xù)對較優(yōu)的數據進行挖掘,通過Minitab 19 軟件設計Box-Behnken試驗[4],進一步對顯著影響培養(yǎng)的重要因素條件進行分析,建立三因素三水平的響應面試驗設計,見表2,然后按設計實施試驗,將試驗結果匯總至Minitab 19 的新建列中,分析響應曲面設計。

表2 響應面試驗水平設計表

1.3.1.4 延長時間培養(yǎng)

篩選到的培養(yǎng)基組成比例及合適初始條件后,無菌操作接種大腸桿菌菌種,轉移到IS-RDV1型號的立式恒溫振蕩器,開始搖床振蕩培養(yǎng),設置轉速200 r/min,設置溫度37 ℃,并且將培養(yǎng)時間延長至16 h 左右,過程中取樣,使用NanoDrop One超微量紫外分光光度計檢測發(fā)酵液OD600值,并對隨時間變化的OD600值進行簡要的曲線描述,驗證篩選后的培養(yǎng)基是否符合培養(yǎng)需求,確認對數生長期及對菌體生長程度進行量化。過程中觀察大腸桿菌的生長OD600,充分了解該重組菌的延滯期、對數生長期、穩(wěn)定期、衰退期,為放大培養(yǎng)提供參考依據,以及驗證尋優(yōu)后的培養(yǎng)基是否符合。

1.3.2 大腸桿菌的發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

尋優(yōu)到可靠的培養(yǎng)成分的組成后,以7 L 罐進行發(fā)酵設計,按比例配制所需要的培養(yǎng)基成分,并加入純化水,攪拌溶解后轉移至潔凈的7 L 發(fā)酵罐內,進行放大培養(yǎng)。整個發(fā)酵分為兩個階段,在發(fā)酵第一階段,即菌體密度富集階段,通過在線連續(xù)地觀察罐內的DO值、pH值、溫度及檢測菌體OD600,鏡檢等措施判斷罐內的發(fā)酵狀態(tài),了解重組大腸桿菌的生長趨勢,避免因生長過快,導致宿主菌的質粒丟失[5],為了防止乙酸的積累,造成菌體發(fā)酵異常,因此在設計初期就選擇了非葡萄糖的碳源進行發(fā)酵[6],當以甘油為糖酵解起始物質時,會由甘油脫氫酶GDH以及二羥基丙酮激酶(DHAK)分別轉化,最終轉化為甘油醛-3-磷酸進入到糖酵解[7]。根據生長節(jié)奏,人為干預調控DO、pH值、攪拌、溫度等重要參數,控制大腸桿菌的生長速率維持略高的水平,進一步減少乙酸積累的負面作用[8],在發(fā)酵第二階段,即產物濃度富集階段,菌體的生長繁殖速率放慢,將其導向產物合成代謝途徑,調整發(fā)酵參數,以最經濟的方式達到產物富集的目的,可適量將誘導階段的溫度降低,以表達產生更穩(wěn)定的可溶性蛋白,并調整合適的溫度,避免包涵體的大量產生,在保證產物表達量高的同時,盡量降低對能耗的需求。

1.3.3 大腸桿菌的發(fā)酵調控研究

重組蛋白在大腸桿菌的表達過程中,經常會由于培養(yǎng)條件的原因,造成翻譯后的肽鏈不同程度的折疊錯誤,導致大腸桿菌在表達中產生不可溶的包涵體,盡管很多學者對包涵體的解決做出了大量的工作以及成效,但仍沒有一種普適性的方法來徹底抑制任意菌株表達產生包涵體[9]。本章進行的發(fā)酵誘導表達的研究,主要從溫度[10-12]、誘導添加物兩方面進行初步的探索,分別進行了37 ℃誘導與22 ℃誘導對比,山梨醇[13-15]添加誘導與甜菜堿[16-17]添加誘導效果試驗。

根據試驗設計,試驗項目包括:(1)37 ℃誘導、(2)22 ℃誘導、(3)加入甜菜堿、(4)加入山梨醇對蛋白表達的影響試驗。在發(fā)酵過程中,取過程樣,以便對微生物發(fā)酵過程中的表達進行了解掌握,這些過程樣品包括:補料前的菌液,誘導前菌液,誘導過程中的菌液,根據情況,至少取1個樣品,誘導結束的菌液。樣品的處理:取樣后,菌液在高速離心機下12 000 r/min,5 min離心處理,再加入水重懸,反復3次,得到菌體重懸液,重懸液再高壓均質機650 bar 左右高壓破碎處理2次,破碎液再次離心,12 000 r/min,15 min后,得到菌體上清以及菌體沉淀,菌體沉淀加純化水重懸至上清相等的體積,再加入5×protein loadingbuffer,煮沸5 min,再上樣電泳。

2 結果

2.1 篩選培養(yǎng)基結果

2.1.1 Plackett-Bumran試驗設計及結果數據

Plackett-Bumran 試驗設計及結果見表3,根據該結果做方差分析,分析表見表4,所預選的8個因素中,A、B、C三個因素的P值<0.05,呈現顯著性,為影響菌體生長的主要因素,其他因素的P值>0.05,D、F、G為正效應,在取值時應取相對高的水平值,E、H為負效應,在取值時應取相對低的水平值。

表3 Plackett-Bumran試驗數據表

表4 Plackett-Bumran試驗方差分析數據表

2.1.2 最陡爬坡試驗結果

最陡爬坡試驗的數據結果見表5。最佳的Y值在第3行的試驗,A值5 g·L-1,B值10.5 g·L-1,C值9.5 g·L-1。

表5 最陡爬坡試驗數據表

2.1.3 響應面試驗結果

Box-Behnken試驗設計及試驗結果見表6。對結果進行回歸分析,所得到的回歸方程各項方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果

表7 回歸方程各項方差分析表

使用Minitab 19 對Box-Behnken試驗結果進行響應曲面分析,得到回歸方程:Y=2.786 67-0.024 75 X1-0.044 00 X2-0.013 75 X3-0.06646 X12-0.055 46 X22-0.077 46 X32-0.019 25 X1X2+0.019 25 X1X3-0.030 25 X2X3,對回歸方程取各項的一階偏導數等于零,并整理得到三元一次方程組:-0.025-0.066 X1-0.019 X2+0.019 X3=0,-0.044-0.055 X2-0.019 X1-0.030 X3=0-0.014-0.077 X3+0.019 X1-0.030 X2=0,通過計算后,換算得到重要因素X1值-0.13,X2值-0.80,X3值0.081,A值4.94 g·L-1,B值8.6 g·L-1,C值9.54 g·L-1。代至回歸方程,得到理論最佳Y值為2.789,結合回歸方程的方差分析,失擬項的P值為0.136>0.05,失擬的顯著性不高,說明該響應面模型與實際培養(yǎng)情況具有較好的擬合性。

2.1.4 延長時間生長培養(yǎng)結果

收集菌體生長OD600值,繪制生長曲線圖,見圖 1。發(fā)現菌體在0到2 h,生長較緩慢,處于適應階段,2到4 h生長繁殖開始旺盛,4到8 h處于對數生長期,8到12 h左右,處于穩(wěn)定期,之后有衰退跡象,搖瓶水平生長OD600最高值為13.59。延長培養(yǎng)后,觀察整個過程,4 h時菌體已經達到旺盛生長的對數前期,菌體OD600值為2.77,與響應面模型理論值接近。

圖1 大腸桿菌OD600隨時間變化圖

2.2 放大培養(yǎng)結果

按尋優(yōu)后的發(fā)酵培養(yǎng)基,接種重組大腸桿菌放大發(fā)酵培養(yǎng),生長到4 h,其中7個批次的OD600已達到11.0～13.2,選擇發(fā)酵較優(yōu)的調控批次,其預先制定的發(fā)酵條件特點是通過調節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、攪拌控制DO值范圍在15%～30%范圍內,維持pH值在6.90～7.10上下幅度0.20 較為寬泛的控制區(qū)間內。使用Origin 9.0 軟件繪制發(fā)酵溫度、pH值、DO值、轉速等重要參數曲線圖(圖 2 ),作為大腸桿菌表達3C 蛋白酶的產業(yè)化放大依據。

圖2 發(fā)酵重要參數全周期曲線

2.3 菌株的發(fā)酵調控研究結果

通過圖3,37 ℃誘導時,據Image J 灰度分析,沉淀表達量約為可溶表達的3倍。通過對比,加入甜菜堿后未見包涵體表達降低,也未見明顯影響可溶3C 蛋白酶的表達。

M:蛋白marker;1:37 ℃ 誘導前的菌上清;2:37 ℃誘導前的菌沉淀;3:37 ℃ 誘導中的菌上清;4:37 ℃誘導的中菌沉淀;5:37 ℃ 誘導末的菌上清;6:37 ℃誘導末的菌沉淀;7:37 ℃ 誘導前的菌上清(甜菜堿);8:37 ℃誘導前的菌沉淀(甜菜堿);9:37 ℃ 誘導中的菌上清(甜菜堿);10:37 ℃誘導中的菌沉淀(甜菜堿);11:37 ℃ 誘導末的菌上清(甜菜堿);12:37 ℃誘導末的菌沉淀(甜菜堿)。

通過圖4,可以觀察到,37 ℃誘導時,加入山梨醇后未見包涵體表達降低,可溶表達量相對偏低。

M:蛋白marker;1:37 ℃ 誘導前的菌上清(山梨醇);2:37 ℃誘導前的菌沉淀(山梨醇);3:37 ℃ 誘導中的菌上清(山梨醇);4:37 ℃誘導中的菌沉淀(山梨醇);5:37 ℃ 誘導末的菌上清(山梨醇);6:37 ℃誘導末的菌沉淀(山梨醇);7:37 ℃ 誘導末菌上清;8:37 ℃誘導末的菌沉淀;9:37 ℃ 誘導末的菌上清(甜菜堿);10:37 ℃誘導末的菌沉淀(甜菜堿);11:37 ℃ 誘導末的菌上清(山梨醇);12:37 ℃誘導末的菌沉淀(山梨醇)。

通過電泳圖5,在補料前及誘導前,非目的蛋白的表達逐漸增加,在目的蛋白條帶位置附近,有明顯的粗條帶。在誘導后均隨著時間增加,可溶表達增加。

M:蛋白marker;1:補料前菌上清;2:補料前菌沉淀;3:誘導前菌上清;4:誘導前菌沉淀;5:誘導2 h菌上清;6:誘導2 h菌沉淀;7:誘導4 h菌上清;8:誘導4 h菌沉淀;9:誘導6 h菌上清;10:誘導6 h菌沉淀;11:誘導8 h菌上清;12:誘導8 h菌沉淀。

根據Image J 灰度分析軟件,對圖5 中的5～12號的3C 蛋白酶所在條帶進行灰度分析,得到灰度分析產生的表達量值,將該表達量值與誘導時間作圖,得到圖6,通過該圖可以觀察到,可溶表達明顯多于包涵體表達,在第2,4,6,8 h,可溶表達與包涵體表達量的比值分別為14.78,5.21,2.18,1.78,隨著可溶表達的增長,包涵體表達也隨可溶表達同步在增長,且二者增長速率接近。另外在22 ℃誘導時,可溶表達為主要表達占比,顯示出低溫誘導能夠明顯降低目的蛋白的包涵體表達。綜合上述研究,相對于37 ℃,誘導溫度22 ℃明顯降低包涵體表達,根據表達情況,可將發(fā)酵結束時間確定在誘導后6 h。

圖6 重組菌在22 ℃誘導不同時間的可溶與包涵體表達量

通過試驗的SDS-PAGE電泳圖判斷,溫度明顯影響3C蛋白酶可溶表達以及3C 蛋白酶總表達量,較高溫度條件下的主要因素同樣也是溫度。甜菜堿以及山梨醇的添加,對于3 C蛋白酶的發(fā)酵表達沒有表現出明顯的提升或者損失。

3 討論

在本研究中,通過借助響應面分析方法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,即通過Plackett-Bumran試驗確認出對菌體生長具有顯著性影響的三個因子,即酵母粉、蛋白胨、甘油,進一步尋優(yōu)確定酵母粉最佳添加濃度4.94 g·L-1,蛋白胨8.60 g·L-1,甘油為9.54 g·L-1。經過放大培養(yǎng),結合大腸桿菌生長特性,確定了pH值在6.90～7.10,DO值在15%～30%,培養(yǎng)溫度37 ℃,誘導溫度22 ℃的發(fā)酵條件,發(fā)酵結束時間確定在誘導后6 h。通過上述研究,最終建立了適合于大腸桿菌表達3C蛋白酶的穩(wěn)定、可行的發(fā)酵工藝,未發(fā)現甜菜堿、山梨醇對降低包涵體表達的明顯促進作用。本研究實施的大腸桿菌產人鼻病毒3 C蛋白酶發(fā)酵工藝研究,為進一步的產業(yè)化發(fā)展提供了依據,具有一定的實際意義。