金納米顆粒的制備及其在電化學生物傳感器中的應用進展

陳雪,李昉,劉樹峰

(青島科技大學 化學與分子工程學院,山東 青島 266042)

近年來,以癌癥為標志的很多重大性疾病對于人類健康生活的影響越來越大,因此對于某些核酸、蛋白質、腫瘤標志物的準確檢測是十分必要的。結合各種生物策略的電化學傳感器層出不窮,并且表現非常突出[1-2]。在電化學生物核酸傳感器中,因其檢測目標的微小,傳感器所處的平臺及介質也須是特定的環境,并且對平臺的要求較高,比如Au電極、玻碳電極的表層面積的控制[3]。在另一方面,為了提高傳感器的靈敏度與特異性,將納米材料應用于傳感器的制造,這也是基于各種物理材料的不斷發展。研究發現,當某些材料的尺度縮小到納米級別時,其中部分的物理性質與化學性質有著顯著的改變,并且還會顯現獨特性能,可能是因為高表面積或量子效應引發的[4-5]。目前,隨著電化學生物傳感器與納米材料的不斷發展,它們可以很好地結合起來應用于生物傳感器中用于更加靈敏準確地檢測。

在電化學生物傳感器中,除了各種生物放大策略(比如雜交鏈式反應、熵驅動、催化發夾組裝、滾環擴增策略等)的應用,DNA自身的各種結構也有著無限可能。DNA的特殊物理化學性質可通過幾種組裝策略來形成高度可預測的結構,這些結構已被貫通在各個領域[6-7]。新的DNA結構設計工具的制備和應用使許多實驗進程變得簡單易操作,并使堿基數目多的和任意的DNA結構對于不同的應用變得可行。此外,DNA所形成的納米結構被認為是生物醫學應用中具有可編輯性和生物相容性的優異材料。傳統來講,DNA的自身納米結構與生物放大策略相結合就可很好地制造傳感器。為進一步提高傳感器的靈敏度與特異性,引入納米材料,將其生物功能化[8]。生物功能納米材料近年來也應用了許多種類,其中金納米顆粒(AuNPs)的許多特性值得我們去探究。

單質金(Au)是化學性質最穩定的元素之一,納米尺寸級別的金除此之外還具有特殊的物理化學性質、光電性質以及生物相容性[9]。納米材料(NMs)為環境、食品安全和臨床診斷應用的電化學生物傳感器提供了眾多優勢,包括實現了較低的檢測限(LOD)。由于納米材料具有較大的表面積和較高的負載能力,已有多種信號增強策略被報道利用納米材料作為多種信號分子和生物識別元素的載體。由于許多納米材料具有電化學活性(如金屬納米顆粒)。它們還被用作電活性示蹤劑,以生產具有增強性能的納米結構電化學傳感器,并被用作催化劑,其表面具有現成的活性位點[10]。金納米粒子(AuNPs)可能是生物傳感器中使用最廣泛的納米粒子,因為它們的化學合成快速簡單,具有形狀控制和窄尺寸分布、生物相容性以及易于生物結合。在電化學生物傳感器方面,AuNPs因其獨特的電化學特性而引起了人們的特別興趣,這使得各種生物傳感器的開發成為可能。因此,在眾多的納米材料中,金納米顆粒(AuNPs)是科研工作者研究最多的,在生物傳感、疾病診斷、醫療等方面有著很好的應用前景。金納米顆粒的制備及特性我們還需繼續深入探究,其在生物傳感器中的應用已經成為放大信號的一種常用手段。

1 金納米顆粒(AuNPs)的制備

檸檬酸三鈉還原四氯金酸:將200 mL的0.01%的HAuCl4溶液攪拌煮沸后,將5 mL的1%檸檬酸三鈉溶液快速加入煮沸的溶液中。當溶液變成深紅色,表明金納米顆粒的形成,此時將溶液繼續攪拌并冷卻,得到穩定的金納米膠體。后續對于金納米顆粒的表征,對于純度,在紫外-可見光范圍內出現一個特定位置的特征峰即可證明金膠的完好制備,再根據其吸光度(朗伯-比爾定律)就可計算金納米顆粒的濃度。透射電鏡下其形狀更直觀一點。上述0.01%的HAuCl4溶液與1%檸檬酸三鈉溶液的比例所制得的金納米顆粒粒徑較小,其不同的比例所形成的粒徑大小是不同的,根據實驗狀況進行調整。

2 金納米顆粒的性質[11]

2.1 電化學特性

金本身就具導電性,納米金也有著良好的導電性,可增強原本電極的導電性。因其電化學特性,AuNPs更多地適用于電化學生物傳感器。

2.2 易于表面修飾

一方面,體積更小,比表面積更大;最重要的是,金達到納米尺寸后,顆粒表面總是覆有一層保護劑分子,就可利用分子間的相互作用將這些分子與特定的試劑反應,以得到想要修飾的基團或環境。還可用作催化劑,在其表面上具有現成的活性位點。因此,金納米顆粒可以較容易地被多種分子修飾,被應用于生物傳感器中,并將其功能和應用擴展到化學分析、生物醫學等領域中。

2.3 局部表面等離子體共振(SPR)

AuNPs表面的特殊性(帶有自由電子),會在入射光的作用下形成表面等離子體共振效應,在紫外-可見光范圍內會出現一個特征峰。合成金納米顆粒后,只需紫外表征就可判斷是否制備成功,驗證AuNPs上修飾DNA是否成功也可用此方法(若DNA修飾成功后,其體積會略增大,與AuNPs自身的出峰位置相比會向長波長方向移動)。由于金納米顆粒間等離子體激元耦合效應,金納米顆粒之間的分散與聚集過程會伴隨從紅色到藍色的顏色變化,這是肉眼就可觀察到現象,鹽度等許多環境變化都會影響金納米顆粒的聚集與分散程度,成為開發比色生物傳感器的通用范例。

3 金納米顆粒在電化學生物傳感器中的應用

金納米顆粒(AuNPs)可能是生物傳感器中使用最廣泛的納米粒子,因為它們的化學合成快速簡單,具有形狀和窄尺寸分布可控性、生物相容性和易生物結合性。對于電化學生物傳感器而言,AuNPs因其獨特的電化學特性,使得各種生物傳感器的開發成為可能。迄今為止制造的大多數基于AuNPs的電化學生物傳感器都報道了AuNPs作為電化學標記或分析物受體的載體,或作為電極表面的改性劑的用途,通常與聚合物和石墨烯結合或與其他納米材料結合。

3.1 金納米顆粒與碳納米管的結合用于超靈敏電化學DNA生物傳感器的制造

納米材料已廣泛應用于電化學生物傳感系統,用于高靈敏度和高選擇性地檢測各種生物目標。金納米顆粒自身就具有獨特優勢,還可與其他納米材料結合協同放大信號。基于“海膽狀”碳納米管-金納米顆粒(CNT-AuNPs)納米團簇,Han等人[12]開發了一種簡單、無標記、超靈敏的三明治型電化學DNA生物傳感器,用于DNA檢測時的信號放大(如圖1所示)。具體來說,多巴胺(DA)的電化學聚合被用于修飾金電極,通過席夫堿反應將胺基修飾的探針DNA (NH2-ssDNA)共價連接到聚多巴胺(PDA)功能化的金電極表面來制備DNA生物傳感器,其中PDA的茶酚官能團與胺基修飾的DNA偶聯,以將DNA探針錨定在PDA的界面上。此時為無靶的狀態,即原始狀態。當有靶標(T-DNA)存在時,通過與P-DNA雜交,暴露出一個位點,將雙鏈DNA功能化的AuNPs引入傳感器中。之后,末端修飾的單壁碳納米管通過位點與DNA雜交連接到金納米粒子表面,形成三維放射狀納米團簇,產生顯著的電化學響應。由于DNA鏈的柔性、相對大質量的AuNPs和共軛CNT的大接觸表面積,CNT-AuNPs納米簇被定位在金電極表面附近,有著非常高效的電子轉移。所以,利用簡單的電化學表征:循環伏安法(CV)、電化學阻抗譜(EIS)和線性掃描伏安法(LSV),就可對DNA生物傳感器的制備過程和性能進行可行性的驗證。由于碳納米管-金納米顆粒具有更大的接觸表面積和超電子導電性,這種新設計的3D DNA納米結構顯示出對DNA的超靈敏檢測,檢測極限為5.2 fM (線性范圍為0.1 pmol/L至10 nmol/L),以及在最優環境下區分單錯配DNA和完全匹配的目標DNA的高選擇性。這種生物傳感器結合了碳納米管和金納米粒子的協同特性,展現出了高準確性、強特異性的信號放大策略,用于實現對DNA檢測和診斷應用的靈敏電化學生物傳感器。

圖1 電化學DNA生物傳感器的制造和檢測過程示意圖

3.2 金納米顆粒應用于電化學生物傳感器中以提高靈敏度

金納米粒子(AuNPs)已經被開發應用于電化學生物傳感器中,由于單個金納米顆粒幾乎都會裝載數百條DNA鏈,這為靶標的檢測提供了顯著的擴增。再結合其他策略,待測靶標就可被特異性地檢測到,檢測限相對較低。Ge等人[13]設計了一種無需聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的簇狀規則間隔短回文重復序列(CRISPR)/Cas12a介導的雙模式電化學生物傳感器(圖2),用于檢測轉基因大豆SHZD32-1。合成了功能化的復合生物納米材料Fe3O4@AuNPs/DNA Fc&Ru作為信號單元,選擇SHZD32-1的特征基因片段作為靶DNA (tDNA)。當Cas12a、crRNA和tDNA同時存在時,形成了三元復合物Cas12a-crRNA-tDNA,并且激活了CRISPR/Cas12a系統對單鏈DNA的非特異性切割能力。因此,信號單元中的單鏈DNA-Fc被切割,導致二茂鐵(Fc)的快速掃描伏安(FSV)信號的降低和被Fc抑制的釕絡合物(Ru)的電化學發光(ECL)信號的增加。AuNPs的加入使得信號數倍擴增,檢測限達到預期的效果。其中,ECL和FSV的線性范圍分別為1～107 fM/L和10～108 fM/L,ECL和FSV的檢測限分別為0.3 fM/L和3 fMl/L。準確度、精密度、穩定性、選擇性和可靠性均令人滿意。此外,無PCR檢測可在室溫下一小時內完成,無需復雜的操作和樣品處理,在轉基因作物的實際應用檢測中顯示出巨大的潛力。并且可以有助于開發更加環境友好的基于AuNPs的電化學生物傳感器。且由于電化學發光(ECL)和快速掃描伏安(FSV)信號可以交叉驗證,因此準確度和可靠性很高。這種生物傳感器為高靈敏度、精確和特定的轉基因生物現場檢測提供了新的解決方案,并為CRISPR/Cas12a系統在傳感器開發中的應用提供了新思路。對于以上無生物擴增策略的電化學生物傳感器的制造,AuNPs是擴增信號中的重要組成部分。

圖2 用于轉基因大豆無PCR檢測的CRISPR/Cas12a介導的雙模式電化學生物傳感器示意圖

綜上所述,基于CRISPR/Cas12a系統開發了一種用于檢測轉基因大豆的雙模式電化學生物傳感器,該傳感器具有以下顯著優勢:(1) 高靈敏度,檢測限低至0.3 fM/L,可檢測低濃度轉基因成分;(2) 高選擇性,普通干擾不會影響檢測;(3) 準確度高,相對標準偏差不超過114%和11%;(4)高信賴性,ECL和FSV信號可以交叉驗證,可避免假陰性或假陽性結果;(5)簡單的實驗步驟,只要制備好傳感器,檢測就可一步完成;(6) 溫和的實驗環境,可在室溫下進行,無需PCR擴增;(7) 反應時間短,可在1 h內完成。因此,這種雙模式電化學生物傳感器在轉基因作物及產品的快速檢測領域具有良好的應用潛力。

3.3 金納米顆粒(AuNPs)制造的電化學DNA傳感器用于多核苷酸激酶的檢測

金納米顆粒因其良好的導電性被廣泛應用,又因其體積小,比表面積大,和其他的生物納米材料結合在電化學生物傳感器中應用有著更優的效果。T4多核苷酸激酶(PNK)活性的測定和PNK抑制劑的篩選對于疾病診斷和藥物發現至關重要。已經應用了許多電化學策略用于PNK活性和抑制的靈敏測量,然而之前的策略中經常會有其他的分子標記和電化學讀出的檢測過程的多個步驟。在此展示了一種電化學DNA (E-DNA)傳感器,用于一步檢測PNK,具有“信號開啟”讀出功能,不需要額外的分子標記修飾。在面圖3中,Lin等人[14]設計了高度可切換的雙鏈DNA (dsDNA)探針被固定在金納米粒子修飾的二硫化鉬納米材料(MoS2-AuNPs)上,該納米材料具有大表面積和高電導率,用于提高PNK檢測中的信號增益。這種集成了MoS2-AuNPs的“Signal-ON”E-DNA傳感器比沒有MoS2-AuNPs的傳感器具有更高的靈敏度,檢測極限為2.18×104U/mL。此外,該體系的分析結果顯示出高選擇性,能夠將PNK與其他酶和蛋白質區分開,并可用于篩選抑制劑。MoS2-AuNPs已被廣泛用作電極修飾材料,以提高小分子、蛋白質和核酸的超靈敏檢測的導電性。該傳感器結合了電化學DNA傳感器和MoS2-AuNPs的優點:(1) E-DNA傳感器易于制造,能夠以高靈敏度直接檢測復雜樣品中的PNK,顯示出臨床應用的潛力;(2) 與報道的具有最大信號抑制限制的“Signal-OFF”生物傳感器相比,該傳感器產生的“Signal-ON”電化學信號更穩定;(3) 一步和無試劑的便利性和信號穩定性使得傳感器能夠實時監測PNK的活性;(4) MoS2-AuNPs不僅可以提供有效的DNA固定面積,而且加快電化學標記分子的電子傳遞,增強法拉第電流,從而提高PNK檢測的靈敏度。經實驗證明,這種E-DNA傳感器可以靈敏地檢測緩沖液和細胞裂解液中的PNK,篩選PNK抑制劑,并可以進一步用于疾病診斷和藥物發現。

圖3 用于檢測PNK活性的E-DNA信號傳感器的示意圖

4 結語

介紹了金納米顆粒的制備方法,金納米顆粒的特性及其在電化學生物傳感器中的應用。金納米顆粒在電化學生物傳感器中起到了很強的擴增信號的作用,并通過其導電性、電化學特性、AuNPs局部表面等離子體共振等特性來制備更精準靈敏的傳感器,在未來的化學分析、生物傳感、疾病診斷等方向有著很大的應用潛力。