蛋雞卵泡發育及其表觀遺傳調控機制研究進展

茹 盟,曾文惠,彭劍玲,曾慶節,殷 超,崔 勇,魏 慶,梁海平,謝賢華,黃建珍

(江西農業大學動物科技學院,南昌 330045)

家雞(Gallusgallusdomesticus)包括肉雞(產肉)和蛋雞(產蛋),在我國具有巨大的農業生產價值。在生產中,雞蛋是優選蛋白來源之一,含有人類全部的必需氨基酸且所含營養物質易吸收,是最主要的經濟來源[1]。蛋雞產蛋全程可分為3個階段:產蛋前期、高峰期和后期。從產第一顆蛋到產蛋率達到80%之前的這段時間是產蛋前期,在此之后,蛋雞產蛋率大幅度上升進入產蛋高峰期;高峰期維持一段時間之后,蛋雞產蛋率會慢慢下降至80%,此時為產蛋后期。如今生產上一般通過調控外在因素來提高蛋雞產蛋率,然而禽蛋生產仍未達到最優化。蛋雞過快進入產蛋后期導致蛋雞的產蛋率從產蛋高峰的90%急速下降到50%～70%。產蛋率下降的主要原因是等級前卵泡數量下降、閉鎖和退化卵泡增加,進入等級的排卵前卵泡數量降低,從而導致排卵率降低[2]。在畜禽的研究中,表觀遺傳調控可能通過激活或者是沉默卵泡發育過程中的關鍵基因來調控這一過程,因此深入研究表觀遺傳調控機制可能對提高蛋雞產蛋率有一定的指導意義。

1 蛋雞卵泡的發育

蛋雞右側卵巢在生長過程中發生退化,只有左側卵巢正常發育并具有生殖能力。性成熟后左側卵巢由大小不同的卵泡通過卵巢系膜韌帶連接成一串葡萄狀。卵泡根據發育程度不同分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡。成熟卵泡主要由膜細胞層、顆粒細胞層和卵母細胞層組成,主要成分是卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)、極低密度脂蛋白y(very low-density lipoprotein yolk-targeted, VLDLy)和活性蛋白(主要包括α、β、γ蛋白)[3]。在卵泡發育過程中,卵泡的不同細胞層也隨之增殖分化。膜細胞層在次級卵泡中出現并分化成、內外兩層,當卵泡發育至成熟卵泡后變厚,且內、外兩層更為明顯。在原始卵泡中,顆粒細胞層未分化,為扁平狀,在次級卵泡中變為多層,當卵泡發育成成熟卵泡后又變為單層,且體積增大。卵母細胞層一直處于初級卵母細胞狀態,直至卵泡發育至成熟卵泡后才發育成次級卵母細胞,之后卵泡破裂,卵母細胞逸出,遺留下來的組織被稱為排卵后卵泡(postovulatory follicle, POF)[4]。在完成排卵之后,家禽POF不能像哺乳動物卵泡一樣形成黃體,而是開始逐漸退化,并在幾天后消失[5]。

家禽卵泡發育是一個連續且分級的過程,原始卵泡發育后向卵巢皮質表面凸出,形成等級前卵泡,之后經卵泡選擇進入等級卵泡期,然后依次進行排卵或卵泡閉鎖終止,其發育過程如圖1所示。功能成熟的卵巢中含有數百個等級前卵泡[6],包括小白卵泡(small white follicles, SWFs)、大白卵泡(large white follicles, LWFs)、小黃卵泡(small yellow follicles, SYFs)和5～7個生長中的排卵前卵泡(其按體積順序劃分為FN、…、F4、F3、F2和F1),以及5～7個POF[7-8]。國內外大量研究發現,不同等級卵泡分類有著不同的方法,具體見表1。在產蛋高峰期時,生殖活躍的母雞的卵巢每天募集1個SYF發育至等級卵泡[9],等級卵泡繼續快速生長發育,從F6卵泡發育到F1卵泡,直到排卵。然而母雞一生中超過95%的卵泡沒有發育至成熟排卵,它們在發育過程中發生退化、解體,最后被吸收[10]。雞卵泡的生長發育在很大程度上是通過卵黃的積累完成的。卵黃蛋白通過血管化的卵泡細胞膜層進入卵泡后,穿過基膜,通過顆粒細胞(granulosa cells, GCs)之間的緊密連接進入卵母細胞[11],該過程是由極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein, VLDL)受體介導的胞吞作用完成的[12]。

表1 卵泡的分類Table 1 Classification of follicles

圖1 家禽卵泡發育過程Fig.1 The process of follicular development in poultry

當母雞產蛋率到達產蛋后期時,母雞卵巢中大多數卵泡(等級前卵泡)發生卵泡閉鎖。細胞凋亡使禽類卵泡發生閉鎖,且主要是顆粒層細胞的凋亡[20]。但最近的研究表明,自噬在卵泡發育中也起著重要的作用[21]。自噬是指在自噬基因的調控下自身細胞成分和受損細胞器受到溶酶體降解的過程,是生殖細胞的一種自我保護機制[22-23]。研究發現,卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)通過低氧誘導因子1α(hypoxic-inducible factor-1α, HIF-1α)信號誘導卵巢GCs自噬來促進卵泡閉鎖[24],然而FSH也可以抑制卵巢GCs自噬來增強細胞活力[25]。因此,細胞凋亡和自噬對于蛋雞卵泡發育至關重要,這將確保蛋雞在產蛋期間有足夠的卵泡可發育成成熟卵泡。

2 影響蛋雞卵泡發育的主要因素

蛋雞卵泡發育過程受到許多內在和外在因素的調控,內在因素主要包括激素及細胞因子的調節,外在因素主要是營養水平的調節和氧化應激。

2.1 內在因素對卵泡發育的調節

2.1.1 激素對卵泡發育的調節 雞的卵泡發育受下丘腦-垂體-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian, HPO)軸上的多種激素共同調控。下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(gonadotrophin releasing hormone, GnRH)主要是通過控制促性腺激素的分泌而發揮對卵泡發育的調節作用[26]。垂體分泌的促性腺激素是黃體生成素(luteinizing hormone, LH)和FSH,主要影響卵巢類固醇激素的合成。在蛋雞體內,適宜的FSH和LH濃度可以迅速地刺激卵泡生長、發育和排卵,從而增加產蛋量[27]。類固醇激素(如孕激素和雌激素)合成于卵巢和卵泡,是維持卵泡正常發育、增強動物繁殖性能所必需的,其合成途徑如圖2所示。孕激素(progesterone, P)有促進排卵的作用。雌激素(estradiol, E2)是禽類雌性動物卵巢發育的關鍵調節物,具有調節性腺分化和發育、生殖行為及肝臟中卵黃前體物質合成的功能。蛋雞卵泡發育還受其他內分泌激素的影響,比如胃促生長素(ghrelin)[28]、kisspeptin[29]、瘦素(leptin)[30]等。

圖2 家禽類固醇激素的生成過程[31]Fig.2 The process of steroid hormones production in pourty[31]

2.1.2 細胞因子對卵泡發育的調節 轉化生長因子β超家族(transforming growth factor-β, TGF-β)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和其他細胞因子是影響蛋雞卵泡發育的重要因素[31-32]。在雞卵泡的發育過程中,Zhou等[33]研究發現TGF-β1可刺激GCs分泌膠原蛋白,促進膜細胞增殖,從而通過細胞間的通訊促進卵泡的發育。EGF可通過參與Smads信號通路、TACE/ADAM17信號通路、MAPK信號通路等多種與卵泡發育相關的信號通路來調控家禽卵泡的發育[34]。因此,這些細胞因子具有調控細胞增殖與分化、類固醇激素生成、卵泡選擇、控制排卵率的作用[35]。

2.2 外在因素對卵泡發育的調節

2.2.1 蛋雞營養水平對卵泡發育的調節 日糧能量充足是蛋雞生殖性能的保障。研究表明,在日糧中保持適當的能量水平可提供足夠的能量和營養攝入,以滿足其體重增加、骨骼和生殖系統發育的需求[36]。然而,營養過剩會導致雞體重增加至過肥,引起多囊卵巢綜合癥[37]、脂肪肝[38]等代謝性疾病,從而導致雞產蛋率急劇下降甚至死亡,最終造成巨大的經濟損失。長期的高糖高脂飲食會造成機體高胰島素血癥和高脂血癥,使卵巢卵泡發育受損[39],降低血清中類固醇激素(包括P、E2和睪酮)的水平[40]。相較于自由飲食,8～18周齡蛋雞進行適當的能量限制(85.97%,2 450 kcal AMEn·kg-1)可以提高蛋雞整個產蛋期的蛋重和產蛋量[41]。由此可知,營養水平是蛋雞產蛋性能的重要影響因素。

2.2.2 環境對卵泡發育的調節 卵巢氧化應激是影響蛋雞卵泡發育的重要外界因素。Li等[42]研究發現,熱應激通過激活FasL/Fas和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)通路誘導細胞凋亡,導致等級卵泡數量減少,閉鎖卵泡增加,蛋雞產蛋率急劇下降,從而降低蛋雞的產蛋性能。此外,遮光也可以造成蛋雞卵巢氧化應激,其通過各種途徑影響蛋雞卵泡發育,從而降低其產蛋效率[43]。研究發現,抗氧化劑可以緩解蛋雞卵巢的氧化應激,從而改善蛋雞的卵泡發育,提高蛋雞產蛋性能[44]。這可能是緩解環境對卵泡發育影響的有效措施之一。

3 卵泡發育的表觀遺傳調控機制

動物卵泡的發育涉及基因有序的轉錄激活和抑制等一系列復雜的生命過程,這對雌性的繁殖性能至關重要。在DNA序列不改變的前提下,表觀遺傳修飾引起基因表達改變或細胞表型發生變化是卵泡發育中重要的調控機制之一[45]。表觀遺傳主要通過DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調控、RNA修飾以及染色質重塑等5種方式在轉錄和轉錄后水平對卵泡發育相關基因的表達進行調控。

3.1 卵泡發育的DNA甲基化調控

DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosine methionine, SAM)作為甲基供體,將胞嘧啶轉化為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)的過程[46]。這是一種在轉錄水平調控基因表達的表觀遺傳修飾方式,也是目前了解和研究最多的表觀遺傳調控機制之一。大量研究發現,DNA甲基化與卵泡發育之間存在密切聯系。例如,大麻處理的小鼠卵巢顆粒細胞出現DNA甲基化水平增加,且其中三分之二的DNA甲基化差異位點影響基因的轉錄[47]。多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)患者的血清、卵巢、下丘腦、骨骼肌、脂肪組織均檢測到基因的異常DNA甲基化,且這些基因所在的通路與PCOS的胰島素抵抗、脂質代謝和卵泡發育密切相關[48]。另有研究表明,與類固醇合成相關基因[49-50]及與卵泡凋亡和細胞周期相關基因的異常DNA甲基化會導致卵泡發育異常[51]。DNA甲基化異常甚至可以導致細胞癌變,表現為總體上甲基化水平降低而局部甲基化水平升高[52]。DNA甲基化主要發生在啟動子區域CpG島。CpG差異甲基化區(differential methylated regions, DMRs)是重要的表觀遺傳修飾標記和參與基因轉錄的功能區[53]。正常情況下,GCs啟動子區域的CpG島發生甲基化,抑制基因的轉錄,細胞發育正常,而在卵巢癌中,CpG島不發生甲基化,下游基因被激活,細胞發育異常(圖3)[54]。因此,蛋雞也可以作為動物模型來研究人類卵巢癌[55]。

圖3 DNA甲基化在顆粒細胞發育中的作用[54]Fig.3 The role of DNA methylation in granulosa cell development[54]

3.2 卵泡發育的組蛋白修飾調控

組蛋白修飾也是調控卵泡發育的主要表觀調控機制之一,主要通過組蛋白的N端發生乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化等修飾影響基因的轉錄[56]。其中甲基化和乙酰化修飾為調控蛋白提供附著位點影響染色質的結構和活性。組蛋白乙酰化是一種可逆的動態過程,乙酰化和去乙酰化分別由組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白去乙酰化酶調控[57]。研究發現,組蛋白乙酰化可促進轉錄,而去乙酰化可以促進基因沉默或抑制[58]。在雞的卵泡發育過程中,Li等[59]利用不同等級卵泡的GCs通過ChIP-seq分析得到H3K27ac(活性增強子上的典型組蛋白標記物)圖譜,之后通過ATAC-seq和scRNA-seq聯合分析,發現基因表達和染色質結構變化是一致的。組蛋白乙酰化也會影響類固醇激素生成相關基因的表達,在小鼠卵巢GCs中,丁酸鹽通過H3K9ac調控PPARγ和PGC1α信號通路上基因的表達促進類固醇激素生成[60]。

組蛋白甲基化是最穩定的組蛋白修飾,其中組蛋白H3和H4的賴氨酸(K)側鏈上單、雙、三甲基化在卵泡和卵母細胞的發育等生理過程中起著至關重要的作用[61-62]。研究表明,當特異性敲除卵母細胞中組蛋白去甲基化酶的編碼基因Kdm2a后,其激素敏感性降低,且卵母細胞發育停滯、形態異常增多[63]。此外,衰老引起蛋雞繁殖能力下降、卵泡發育受損的機制可能與組蛋白甲基化失調有關。在老年小鼠卵泡發育過程中,卵母細胞H3K36me3降低,線粒體凝集增加,細胞凋亡增加導致發情周期縮短,E2濃度降低,卵巢內卵泡數量減少,輸卵管上皮組織結構紊亂[64]。

3.3 卵泡發育的非編碼RNA調控

非編碼序列是一種基因轉錄后表達調控因子,在細胞增殖、分化、凋亡等生理過程中發揮著至關重要的作用[65]。大量關于非編碼RNA調控蛋雞卵泡發育的研究主要集中在miRNA(microRNA)、lnc-RNA(long non-coding RNA)、circRNA(circular RNA)。

miRNA是短鏈非編碼RNA,在轉錄后調節基因表達。最近,許多研究揭示了卵巢卵泡發育的miRNA調控機制[66]。Song等[67]研究發現,雌性小鼠暴露于多種擬除蟲菊酯類殺蟲劑后,次級卵泡數量顯著減少,閉鎖卵泡數量增加,顆粒細胞凋亡增加,通過RNA-seq分析發現其卵巢內miR-152-3p、miR-450b-3p和miR-196a-5p水平顯著上調。miRNA在蛋雞卵巢發育過程中的調控作用也多有研究。相較于低產蛋雞,高產蛋雞卵巢的RNA-seq結果顯示11個主要參與類固醇激素生物合成的miRNA表達增高,并且另外3個miRNA(gga-miR-34b、gga-miR-34c和gga-miR-216b)參與調控細胞增殖、周期、凋亡等過程[68]。另有研究表明,miR-1a和miR-21的表達量在雞成熟期和未成熟期的卵巢及不同等級的卵泡中出現極顯著變化[69]。gga-miR-449b-5p靶向GF2BP3基因調控雞卵巢GCs類固醇激素的合成[70],miR-196b-5p表達量的降低會促進GCs的凋亡和抑制GCs的增殖[71],miR-143-3p靶向卵泡刺激素受體,對GCs分化和卵泡發育至關重要[72]。因此,miRNA通過調控卵巢發育和激素生成相關的靶基因發揮作用。

lncRNA是長度超過200個核苷酸,缺乏蛋白質編碼功能的長鏈非編碼RNA,在卵泡發育中發揮著不可或缺的作用[73]。據報道,高產蛋雞(海蘭褐)與低產蛋雞(壩上長尾雞)卵泡的RNA-seq結果發現了550種差異lncRNA,且這些lncRNA主要參與卵母細胞減數分裂、卵母細胞成熟和細胞周期等生物學過程[74]。卵泡發育抑制因子(inhibitory factor of follicular development, IFFD)是一個與卵泡發育相關的lncRNA,可以通過抑制GCs增殖和E2分泌促進GCs凋亡來抑制卵泡發育[75]。

circRNA是一種新型的非編碼RNA,在蛋雞的卵泡發育上也有相關研究。Wang等[72]對不同光照處理的蛋雞SYFs構建GCs的circRNA圖譜,發現這些circRNA主要富集在卵巢類固醇生成、MAPK和PI3K-Akt信號通路。

3.4 卵泡發育的RNA修飾

RNA甲基化修飾包括N6-腺苷酸甲基化(N6-adenylate methylation, m6A)、N1-腺苷酸甲基化(N1-adenylate methylation, m1A)、胞嘧啶羥基化(5-methylcytosine, m5C)。m6A是一種普遍存在的RNA修飾,在細胞活力、增殖、周期中起著重要的調節作用[76]。在2019年,Fan等[77]首次運用高通量測序技術發現m6A在蛋雞卵泡選擇過程中的調控作用。MeRIP-seq的結果發現,m6A甲基化程度在蛋雞的GCs和膜細胞中存在差異,并且Wnt通路上多個關鍵基因的mRNA甲基化程度與mRNA表達水平更高,表明m6A修飾可能通過調節Wnt通路發揮其重要作用。m6A修飾對其他動物卵泡發育的調控也有一定研究。m6A可以修飾牦牛卵巢中BNC1、HOMER1、BMP15、BMP6、GPX3和WNT11等與性激素分泌相關基因的mRNA甲基化程度,調節牛卵泡生長發育,影響牦牛的發情周期[78]。在豬的卵泡發育過程中,Cao等[79]對顆粒細胞構建m6A修飾圖譜,表明m6A修飾可能調控GCs類固醇生成和卵子生成相關通路,以此來影響卵泡發育。

4 小 結

綜上所述,在DNA序列不發生改變的情況下,表觀遺傳調控對蛋雞卵泡發育起著重要的作用。在了解家禽卵泡發育如何受激素、細胞因子、環境及營養等影響的基礎上,深入研究家禽卵泡發育的表觀遺傳調控機制,是后續提高蛋雞產蛋性能和繁殖性能的重點。目前,表觀遺傳對蛋雞卵泡發育的研究基本上都是在顆粒細胞層和顆粒細胞模型上進行的,且主要聚焦在非編碼RNA的調控機制。因此,禽類卵泡發育的表觀遺傳調控機制可以在整體水平上多角度深入研究。可以借鑒小鼠上的研究思路,同時結合新的三代測序、代謝組、單細胞測序和空間轉錄組等新技術擴展表觀遺傳對卵泡發育調控機制的新思路。