基于RT-RAA的禽流感H5亞型核酸CRISPR-Cas13a檢測方法的建立

楊芷翊,王新凱,2,史玉婷,付思源,張鈺炘,曹琛福,賈偉新*

(1.華南農業大學獸醫學院 國家禽流感專業實驗室(廣州)/廣東省人獸共患病防控制劑工程實驗室/人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室/農業農村部人畜共患病重點實驗室/廣東省動物源性人獸共患病防控重點實驗室,廣州 510642;2.深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心,深圳 518045)

禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)是禽流行性感冒(禽流感)的病原,含有8個單鏈負鏈RNA片段,包含在獨立的病毒核糖核蛋白復合物(vRNPs)中[1]。根據禽流感病毒對雞的致病性,可將其分為高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。HPAIV主要包括H5和H7兩種亞型,我國H5亞型HPAIV主要有H5N1、H5N6和H5N8三種亞型[2]。近年來,高致病性H5亞型禽流感疫情規模之大和地理分布之廣前所未有,不僅在亞洲、歐洲和非洲的家禽中流行,也引起了人的偶發感染[3],嚴重威脅家禽業和人類健康[4]。對H5亞型HPAIV的早期精準監測是控制H5亞型禽流感的關鍵措施。

目前,對于H5亞型HPAIV的檢測主要包括病毒分離培養、抗原抗體檢測和分子生物學檢測。病毒分離培養法是診斷禽流感病毒感染的“金標準”[5],其檢測準確率高、檢測結果完整,但耗時長且工作量大,不適合H5亞型禽流感爆發時的大規模檢測。基于抗原抗體的AIV H5亞型檢測方法種類繁多,研究范圍廣泛,但是不可避免地都會出現抗原抗體檢測法本身存在的缺陷,如檢測過程中會經常出現假陽性反應從而降低檢測結果的可信度,商品化的抗原或抗體可能存在價效差異,制備抗體血清的時間較長等。相比于抗原抗體檢測,分子生物學檢測(核酸檢測)將對病原體檢測的研究提高到了基因分子水平,有著耗時短、靈敏度高、特異性強等優勢,能夠有效地應用于致病菌的快速檢測。

有規律成簇間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相關蛋白在RNA干擾和基因編輯等領域有著巨大的潛力[6]。其中CRISPR相關蛋白Cas13a和Cas12a能在crRNA的引導下特異性切割靶標RNA,并在切割完成后仍保持活性,繼續切割其他非靶標 RNA,即具有“附帶切割”能力[7]。基于Cas12和Cas13的旁切活性,研究團隊開發出各種核酸檢測工具。張鋒實驗室的 Gootenberg 等[8]開發了基于CRISPR-Cas13的特異性高靈敏度酶解報告基因解鎖(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking,SHERLOCK)檢測系統。在反應體系中加入大量信號報告RNA,該RNA一端連有熒光基團,另一端連有猝滅基團,正常情況下報告RNA不發出熒光。當Cas13蛋白-crRNA二元復合體識別底物RNA后,Cas13蛋白被激活,除了特異性地切割底物RNA,還會非特異性地切割環境內的報告分子,釋放信號。Jennifer Doudna團隊的Chen等[9]則基于Cas12a開發了DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter)技術。與SHERLOCK類似,Cas12a/crRNA識別檢測序列后,激活Cas12a的旁切活性,接著切割單鏈DNA報告探針并發出熒光。有研究比較了Cas13a和Cas12a酶的核酸檢測特性和報告酶切割活性,結果顯示靶向RNA的Cas13a在低活化劑濃度下的檢測速度明顯快于靶向DNA的Cas12a[10]。

但僅依靠 Cas 蛋白的切割活性檢測實際樣本存在敏感度不足、耗時長等問題[11]。目前主要的解決方法是與核酸擴增技術聯合,而等溫擴增技術(ITA)的反應過程始終維持在恒定的溫度下,通過添加不同活性的酶和各自特異性引物來達到快速擴增核酸的目的。與其他的核酸擴增技術相比,等溫擴增有快速、高效、特異的優點且無需專用的設備。逆轉錄重組酶輔助擴增(reverse transcription-recombinase aided amplification, RT-RAA)是一種核酸恒溫擴增技術,具有靈敏度高、特異性強、檢測速度快、操作簡便等優點。在室溫下,重組酶可以與引物DNA緊密結合形成聚合物。當引物識別出與之完美匹配的互補序列模板DNA時,在單鏈DNA結合蛋白的幫助下,DNA聚合酶可以打開模板DNA的雙鏈結構,形成新的cDNA鏈,擴增產物呈指數級增長[12]。采用依賴于體溫的RAA核酸擴增技術來提高樣品中的DNA或RNA水平,從而增加CRISPR工具的靈敏度,且這種工具能夠在幾乎任何環境下使用[8]。目前,基于RT-RAA的AIV H5亞型核酸CRISPR-Cas13a檢測方法未見報道。

本研究擬運用CRISPR-Cas13a基因編輯術結合逆轉錄重組酶輔助擴增技術(RT-RAA)建立檢測 AIV H5亞型的新平臺,該類檢測平臺具有新穎、快速、方便等特點,既可以在實驗室完成大批量臨床樣本的檢測,也可以在養殖場等室外環境進行小規模的快速檢測。這將為H5亞型禽流感病毒的臨床檢測提供新的技術手段,也為其他RNA病毒的快速準確檢測提供新思路,具有較廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 質粒與病毒

含有目的基因的pUC57-H5質粒標準品購自生工生物工程(上海)股份有限公司。H3、H5、H6、H7、H9、H10亞型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV),雞新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)、雞傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)和鴨坦布蘇病毒(duck tembusu virus, DTMUV)由華南農業大學國家禽流感專業實驗室(廣州)保存。

1.2 試劑與儀器

RNA提取試劑盒購自上海飛捷生物技術有限公司,RT-RAA核酸擴增試劑(基礎型)購自杭州眾測生物科技有限公司,EZ-10柱式DNA純化試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司,DL1000 DNA Marker購自寶日醫生物技術(北京)有限公司,T7 RNA Polymerase和NTP Buffer Mix購自New England Biolabs,LwaCas13a蛋白購自廣州美格生物科技有限公司,Murine RNase inhibitor(MRI)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。實時熒光PCR儀和Bio-rad恒溫水浴鍋購自Biod-rad公司。

1.3 方法

1.3.1 RT-RAA引物與crRNA序列的設計與合成 從 GISAID數據庫中下載并使用342條AIV H5亞型的HA基因序列,使用DNAStar軟件對比分析序列的保守性,在保守區域內選擇28 bp作為crRNA的目的基因靶向序列。根據RAA引物設計的原則,通過Oligo 7.0軟件設計了RT-RAA引物,設計的引物擴增區域內包含crRNA 的目的基因靶向序列。在RT-RAA上游引物的5′端添加25 bp的T7啟動子序列,序列如表1所示。crRNA由廣州博徠斯生物科技股份有限公司合成,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 基因序列信息Table 1 Gene sequence information

1.3.2 RNA提取與RT-RAA擴增 用RNA提取試劑盒對H5病毒株樣本核酸進行提取后,按照眾測?RT-RAA核酸擴增試劑(基礎型)使用說明書對模板進行RT-RAA擴增。向單個干粉管中加入29.4 μL A Buffer,T7-RAA-F(10 μmol·L-1) 和RAA-R(10 μmol·L-1) 各2 μL,再加入模板和DNase/RNase-Free Water共14.1 μL,向每個反應管蓋內加入 2.5 μL B Buffer,同時用DNase/RNase-Free Water設置陰性對照(NC),蓋上管蓋后上下顛倒混勻7～8次,瞬間離心后,在水浴鍋中42 ℃孵育30 min。將獲得的RT-RAA擴增產物經過DNA純化試劑盒純化,并經2%瓊脂糖凝膠電泳后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序驗證。

1.3.3 CRISPR-Cas13a檢測體系的建立與優化 首先配制CRISPR-Cas13a反應體系:包括crRNA(100 μmol·L-1)1.6 μL、TaqMan探針(50 μmol·L-1)0.64 μL、T7 RNA Polymerase 0.25 μL、NTP Buffer Mix 1.6 μL、MRI(40 U·μL-1) 1 μL、10×T7 RNA Polymerase Buffer 2.0 μL,向反應混合物內分別加入 0.5、1、2、4 μL LwaCas13a蛋白(60 μg·mL-1),加入0.6 μL cDNA(100 ng),用DNase/RNase-Free Water補至20 μL,37 ℃反應20 min,以CRISPR-Cas13a檢測最短時間出現最強熒光信號為準則,確定最佳 LwaCas13a基因編輯蛋白用量。以最佳LwaCas13a蛋白用量配制反應體系,在反應體系中分別加入 0.2、0.4、0.6、0.8、1.6、3.2 μL crRNA(100 μmol·L-1),確定最佳crRNA濃度。運用順序控制變量的方法對CRISPR-Cas13a檢測體系進行優化,其他物質濃度設置如下:TaqMan探針(50 μmol·L-1)0.16、0.32、0.64、1.28 μL;T7 RNA Polymerase 0.25、0.5、1、2 μL;NTP Buffer Mix 0.8、1.2、1.6、2、2.4 μL,最終確定CRISPR-Cas13a的最佳反應體系。

1.3.4 RT-RAA-CRISPR特異性試驗 對AIV H3、H5、H6、H7、H9、H10亞型以及感染家禽的其他常見病毒NDV、IBV、IBDV、DTMUV進行核酸抽提,將抽提的核酸進行RT-RAA擴增并進行純化。使用優化后的CRISPR-Cas13a反應體系進行反應,將DNase/RNase-Free Water作為陰性對照,于37 ℃反應20 min,實時檢測熒光信號,驗證其特異性。

1.3.5 RT-RAA-CRISPR靈敏度試驗 使用pUC57-H5質粒作為標準品,用DNase/RNase-Free Water進行10倍梯度稀釋,設置不同拷貝數(105～1 copies·μL-1)的質粒作為模板進行RT-RAA擴增和CRISPR-Cas13a反應,并用DNase/RNase-Free Water設置陰性對照,檢測該反應的檢出限。

1.3.6 RT-RAA-CRISPR符合性試驗 選取已知的20份陽性和36份陰性臨床樣本,對其進行核酸提取后,運用國標GB/T 18936—2020公布的引物(RT-qPCR-H5F和RT-qPCR-H5R)和探針(RT-qPCR-H5Taq)以及依據標準中提供的反應體系和反應程序進行熒光定量RT-PCR檢測,引物和探針的序列具體見表1。反應體系為:2×RT緩沖液10 μL,酶混合液0.5 μL,上游引物(10 μmol·L-1)0.8 μL,下游引物(10 μmol·L-1)0.8 μL,探針(10 μmol·L-1)0.4 μL,無核酶滅菌水2.5 μL。反應程序為:45 ℃ 反轉錄15 min;95 ℃ 預變性2 min;退火延伸95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40個循環,在每次循環退火延伸時收集熒光信號,按照標準中提供的依據進行結果判定。同時將56份樣品用本研究建立的方法進行 RT-RAA-CRISPR 檢測,比較兩者之間的符合性。

2 結 果

2.1 CRISPR 核酸檢測靶點的篩選與RT-RAA引物序列

為了獲得適用于檢測AIV H5亞型的高效特異性crRNA目的基因的靶向序列,經過對GISAID數據庫中342條AIV H5亞型的HA基因序列進行篩選,根據crRNA設計原則找到合適的保守區域為第1 409位堿基到第1 440位堿基(圖1),該區域保守性一致率為98.1%:第1 416位堿基G占比97.6%,A占比2.4%;第1 429位堿基G占比96.7%,A占比3.3%;其他堿基一致率均>98.8%。因此,在該保守區域內選擇了28 bp作為crRNA目的基因的靶向序列(5′-GCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGT-3′),用于 AIV H5 亞型 CRISPR-Cas13a 核酸檢測靶點。該靶向序列的反向互補序列與36 bp的LwaCas13a 蛋白結合的錨定序列(5′-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3′)共同構成crRNA,詳見表1。

圖1 crRNA保守性分析Fig.1 crRNA conserved analysis

按照RAA引物設計的原則通過Oligo 7.0軟件設計了RT-RAA引物,引物擴增產物長度為198 bp,擴增序列包含crRNA的靶向序列且與之不重合,應用Primer-BLAST進一步檢驗引物的特異性。經過篩選后,在RAA上游引物的5′端添加了25 bp的T7啟動子序列(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′),以便后續對 RT-RAA 擴增產物進行DNA轉錄,序列如表1所示。

2.2 基于RT-RAA的 CRISPR-Cas13a 檢測方法的建立與最佳體系的優化

根據RT-RAA試劑盒說明書將抽提好的核酸擴增為cDNA并純化,凝膠電泳結果如圖2所示,所設計的針對H5病毒株的RT-RAA引物在198 bp的位置擴增出單一特異性條帶,與預期片段大小相符,經測序驗證為正確序列。結果表明,本研究成功設計了可以擴增H5病毒株的RT-RAA引物,可利用擴增產物繼續進行后續試驗。

M. DL1000 DNA Marker;1. H5;2. 陰性對照M. DL1000 DNA Marker; 1. H5; 2. Negative control圖2 RT-RAA擴增結果Fig.2 RT-RAA amplification results

按照順序控制變量逐一優化CRISPR-Cas13a檢測體系,以 CRISPR-Cas13a 檢測最短時間出現最強熒光信號為準則,確定最優反應體系。熒光檢測結果如圖3所示,表明CRISPR-Cas13a的最佳檢測體系為:LwaCas13a蛋白(60 μg·mL-1)2.0 μL、crRNA(100 μmol·L-1)3.2 μL、TaqMan探針(50 μmol·L-1)1.28 μL、T7 RNA Polymerase 0.25 μL、NTP Buffer Mix 2.0 μL、Murine RNase Inhibitor(40 U·μL-1)1 μL、10×Cas13a Reaction Buffer 2.0 μL、10×T7 RNA Polymerase Buffer 2.0 μL,加入0.6 μL cDNA(100 ng)后用DNase/RNase-Free Water補至20 μL,于 37 ℃ 反應20 min,實時檢測 CRISPR-Cas13a 附帶切割釋放的熒光信號。

a. LwaCas13a蛋白用量的優化;b. crRNA 濃度的優化;c. TaqMan探針用量的優化;d. T7 RNA Polymerase用量的優化;e. NTP Buffer Mix用量的優化a. Optimization of LwaCas13a protein dosage; b. Optimization of crRNA concentration; c. Optimization of TaqMan probe concentration; d. Optimization of the amount of T7 RNA Polymerase; e. Optimization of NTP Buffer Mix consumption圖3 CRISPR最佳檢測體系的優化結果Fig.3 Optimized results of CRISPR optimal detection system

2.3 RT-RAA-CRISPR的靈敏度檢測結果

為了評價RT-RAA-CRISPR檢測方法的靈敏度,將pUC57-H5標準質粒用DNase/RNase-Free Water進行10倍梯度稀釋,設置105、104、103、102、10、1 copies·μL-16個檢測濃度梯度,同時設置陰性對照(NC)。熒光檢測結果如圖4所示,反應20 min后,從105copise·μL-1到1 copy·μL-1這6個檢測梯度的熒光值分別為14 553 189、11 586 768、11 375 226、12 802 810、6 765 644.5、841 933.25 a.u.,結果均與陰性對照的熒光值差異具有統計學意義(P<0.05)。結果表明,本研究建立的 RT-RAA-CRISPR 方法檢測AIV H5亞型的靈敏度為 1 copy·μL-1。

圖4 RT-RAA-Cas13a 靈敏度試驗熒光檢測結果Fig.4 Fluorescence detection results of RT-RAA-Cas13a sensitivity test

2.4 RT-RAA-CRISPR的特異性檢測結果

為評價 RT-RAA-CRISPR 檢測方法的特異性,分別用該方法檢測了AIV H3、H5、H6、H7、H9、H10亞型以及NDV、IBV、IBDV、DTMUV的RAA擴增產物。經過CRISPR-Cas13a體系反應后,各樣品熒光強度信號結果如圖5所示。結果表明,H5 病毒株的檢測熒光強度顯著高于 H3、H6、H7、H9、H10、NDV、IBV、IBDV、DTMUV和陰性對照,且與陰性對照有顯著性差異(P<0.01)。說明本研究建立的檢測AIV H5亞型方法特異性良好,與禽流感其他亞型及其他禽病均無交叉反應,可用于特異性檢測AIV H5亞型的病毒。

圖5 RT-RAA-Cas13a 特異性試驗熒光檢測結果Fig.5 Fluorescence results of RT-RAA-Cas13a specific assay

2.5 RT-RAA-CRISPR的臨床樣品檢測結果

為進一步評估RT-RAA-CRISPR核酸檢測方法與國家標準規定熒光定量 RT-PCR方法的一致性,選取了20份AIV H5亞型的陽性臨床樣本和其他36份陰性臨床樣本,進行CRISPR核酸檢測和GB/T 18936—2020熒光定量RT-PCR檢測。結果如表2所示,其中19份熒光RT-PCR方法檢測陽性的樣本全部檢出,特異性為100%,敏感性為95%,符合率為98.2%。

表2 基于RT-RAA的CRISPR臨床樣品檢測結果Table 2 Results of CRISPR clinical samples based on RT-RAA

3 討 論

H5亞型HPAIV傳播快、致死率高,可引起家禽急性死亡,且具有重要的公共衛生意義。從2003年1月至2022年10月,全球21個國家共報告了868例人感染H5N1禽流感病毒的病例,其中456例死亡,致死率高達53%[13]。因此,H5亞型HPAIV的快速、準確分型鑒別診斷對于養禽業和人類健康尤為重要。目前臨床對于AIV H5亞型的檢測方法主要包括病毒分離培養、抗原抗體檢測和分子生物學檢測。病毒分離培養和抗原抗體檢測雖然較為可靠,但同時也受到假陽性率高、檢測周期長、成本高、檢測過程較為復雜等缺點的影響。分子生物學研究可以同時檢測大量樣本,檢測效率高,適合于流感大面積暴發時使用。常用的分子檢測法有普通PCR、多重PCR(Multiplex PCR)、實時熒光定量PCR(Real-time PCR,RT-qPCR)、數字 PCR(digital PCR,dPCR)等。普通PCR和多重PCR雖然引物設計簡單、操作方便,但只能根據凝膠電泳進行定性試驗。實時熒光定量PCR和數字PCR雖然可以進行定量試驗,由于儀器成本高,使用復雜,且需要相關專業人員進行操作,在資源有限的地區無法大范圍推廣。因此,需要找到更合適的方法用于H5亞型禽流感病毒的即時檢驗(point-of-care testing, POCT),即在采樣現場即刻進行分析,省去樣本在實驗室檢驗時的復雜處理程序,快速得到檢驗結果。

核酸的快速檢測是臨床診斷和生物技術應用中不可或缺的一部分。近幾年來,利用CRISPR-Cas酶的附帶切割活性,CRISPR-Cas13實現了對核酸靶標片段的檢測且被迅速開發、應用于核酸診斷。但其單獨使用時靈敏度較低[8],因此,CRISPR-Cas13一般與其他核酸擴增技術一同使用。有研究利用PCR技術穩定性好、實用性強及高效擴增靶序列的特點,建立了基于PCR和CRISPR-Cas13a系統的結核分枝桿菌脫氧核糖核酸(MTB DNA)檢測方法——PCR-CRISPR,其最高靈敏度為10 copies·μL-1[14],但PCR擴增過程所需時間較長,在檢測時間上幾乎沒有優勢。也有研究利用CRISPR/Cas系統結合環介導等溫擴增技術(LAMP)實現了對非洲豬瘟病毒CD2v基因的快速現場化檢測,其檢測靈敏度達到8.88 copies·μL-1[15],但LAMP對引物的要求極高,需要設計4～6對引物,不利于該方法的推廣。基于重組酶介導等溫核酸擴增技術(RAA)與CRISPR-Cas13a技術相結合建立的RT-RAA-CRISPR具有引物設計簡單、反應溫度低、操作簡易、檢測時間短等特點。本研究中對樣本RNA進行提取后,通過RT-RAA進行30 min的核酸反轉錄以及擴增過程,對獲得的cDNA進行純化,再通過CRISPR-Cas13a進行熒光檢測,在37～42 ℃條件下于1 h 20 min內即可完成對RNA病毒樣本的檢測,可通過熒光值直觀判斷出病毒含量,短時間內實現將待測靶標信號放大的同時對樣品進行定量檢測,大幅度提高了核酸檢測的效率。除具有檢測的快速性以外,該方法還具有良好的特異性和靈敏度,其最低檢測限度為1 copy·μL-1,比PCR-CRISPR和LAMP-CRISPR的檢測靈敏度高[14-15]。與其他檢測平臺(如熒光定量PCR)相比,RT-RAA-CRISPR方法的另一個優勢是其使用成本低,該方法中熒光信號也可以通過熒光恒溫擴增儀、酶標儀進行檢測,相較于熒光定量PCR儀價格更加低廉,若采用便攜式熒光檢測儀替代,對檢測環境的要求更低、適應性更好。

4 結 論

本研究成功建立了一種針對AIV H5亞型的基于RT-RAA的CRISPR快速檢測方法,可滿足生產實踐和臨床檢測的需要,為新型H5亞型禽流感病毒檢測方法的開發提供了技術支撐,在H5亞型禽流感病毒的防控、毒株的鑒別診斷以及流行病學調查方面均具有較好的應用價值。