二脒那秦激活ACE2 對非酒精性脂肪肝病大鼠肝線粒體影響研究

張亞峰,朱 斌,馬 暢,張源淑

(南京農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生理生化重點開放實驗室,南京 210095)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種以肝脂肪顯著蓄積為特征的臨床病理綜合征[1]。目前,NAFLD已成為全球高發(fā)病率和高死亡率的疾病之一,且仍然沒有特效藥,尋找針對性強、副作用小并且療效明顯的抗NAFLD藥物意義重大。

線粒體是細胞中能量產(chǎn)生和細胞有氧呼吸的主要場所。正常的肝細胞中有1 000～2 000個線粒體,除提供能量外,還參與肝細胞損傷的病理過程[2]。線粒體功能障礙是HFD誘發(fā)NAFLD發(fā)生和發(fā)展的重要因素[3]。Fouret等[4]研究表明肝脂肪變性進展與線粒體結構和活性變化密切相關。MEEX等[5]研究發(fā)現(xiàn),攝入飽和脂肪酸會降低線粒體呼吸傳遞鏈的效率,導致活性氧的產(chǎn)生和附近結構的損傷,導致NAFLD。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)是腎素血管緊張素系統(tǒng)代償通路的關鍵酶,可降解AngⅡ產(chǎn)生Ang1-7,并通過其MasR發(fā)揮血管舒張、抗炎、抗纖維化、抗凋亡等生物學功能[6]。研究表明,ACE2的產(chǎn)物Ang1-7作用于MasR通過影響肝細胞線粒體呼吸鏈功能進而改善NAFLD[7]。并有研究表明,在mTk2 KO小鼠模型中,線粒體功能障礙與ACE2表達相關,ACE2在線粒體代謝中發(fā)揮作用[8]。NAFLD發(fā)生時, ACE2/Ang1-7/Mas軸激活通過增強胰島素信號傳導,緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和降低ROS水平調(diào)節(jié)肝糖脂代謝[9-11]。

Moraes 等[12]研究表明依那普利通過調(diào)節(jié)ACE/ACE2肝臟表達改善肝脂肪變性和代謝特征。因此,過表達ACE2激活代償通路可能是改善肝疾病的一種有效方法。二脒那秦(diminazene aceturate, DIZE)是一種廣泛使用且毒副作用小的抗寄生蟲藥,2011年,Kulemina和Ostrov[13]發(fā)現(xiàn)DIZE具有激活ACE2的作用,目前已在多種疾病中開展大量研究。已經(jīng)證實DIZE能夠激活ACE2,繼而減輕氧化應激,調(diào)節(jié)脂代謝,緩解NAFLD[14],但其能否通過激活ACE2影響線粒體結構和功能緩解肝脂肪蓄積,目前尚不清楚。并且,目前從DIZE激活ACE2影響線粒體結構功能方面研究NAFLD的報道較少,因此,從線粒體結構功能方面進行了研究。

本試驗通過高脂飼喂SD大鼠建立NAFLD模型,從線粒體生物發(fā)生、融合分裂以及線粒體呼吸鏈復合物角度研究灌胃DIZE后線粒體結構功能的變化,以進一步探討DIZE激活ACE2對NAFLD大鼠線粒體結構和功能的影響,旨在為NAFLD的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 26只6周齡雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200 g ±10 g),購自斯貝福生物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心,環(huán)境溫度22 ℃±2 ℃,濕度55%±5%,12 h光照/黑暗循環(huán)。動物飼養(yǎng)及處理均遵循南京農(nóng)業(yè)大學動物福利與倫理規(guī)范的要求。

1.1.2 主要試劑與器材 二脒那秦(DIZE)購自南京良緯生物科技有限公司;線粒體裂變1蛋白(Fis1)抗體、線粒體融合蛋白 1(Mfn1)抗體均購自巴傲得生物公司;解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)抗體購自萬類生物公司;β-actin 抗體、視神經(jīng)萎縮蛋白 1(OPA1)抗體、動力蛋白相關蛋白 1(Drp1)抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 二抗均購自武漢愛博泰克生物公司;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)抗體購自Abcam公司,所有抗體均為兔源。2×SYBR Green Pro Taq HS Premix購自艾科瑞生物工程有限公司;大鼠 Ang1-7 和 AngⅡ ELISA 檢測試劑盒購自南京奧青生物公司;TG、TC試劑盒購自南京建成生物公司;BCA試劑盒購自碧云天生物公司;ECL化學發(fā)光超敏顯色試劑盒購自上海翌圣生物公司。

POWER-PAC300 電泳儀和POWER-PAC HC 轉(zhuǎn)印儀(美國,Bio-Rad 公司);Tanon-3900全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海,Tanon科技有限公司);Tecan Spark 多功能酶標儀(瑞士,Tecan 公司);TA dvanced 基因擴增儀(德國,Biometra);LightCycler96熒光定量PCR儀(羅氏,Roche公司);Servicebio 高速組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 26只6周齡雄性SD大鼠,適應性喂養(yǎng)1周,稱重后隨機分為對照組(n=9,飼喂脂肪含量為12%的普通飼料)和高脂組(n=17,飼喂脂肪含量為45%的高脂飼料)。參照朱斌等[15]的造模方法,4周后,從兩組大鼠中隨機各取1只,迅速處死后取肝臟觀察肝形態(tài)并做組織病理學切片確認NAFLD模型成功建立。然后將高脂組16只大鼠重新分為2組,具體分組和處理見表1。試驗期間觀察大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤和排便情況,每天下午14:00按時按順序灌胃。試驗周期為70 d。

表1 動物分組及處理 (n=8)Table 1 Grouping and treatment of animals (n=8)

1.2.2 樣品采集 大鼠飼養(yǎng)至第10周末,禁食12 h后,稱重并剖殺大鼠,腹主動脈采血,3 000 r·min-1離心10 min,收集血清,于-20 ℃保存。采集肝臟組織,稱重后取相同部位組織塊于4%多聚甲醛中固定,其余肝組織置于-80 ℃保存。

1.3 肝病理組織學觀察

大鼠飼喂高脂飲食4周后,隨機選擇對照組和高脂組大鼠各1只,麻醉處死采集肝臟組織,取相同部位肝組織于4%多聚甲醛中固定24 h,石蠟切片送南京武漢賽維爾生物公司進行制作。光學顯微鏡觀察肝組織形態(tài)學變化。

1.4 血清中TG、TC含量的測定

測定血清中總膽固醇(TC)及三酰甘油(TG)的含量,具體步驟按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 肝中AngⅡ和 Ang1-7含量的測定

ELISA 法測定肝組織中AngⅡ和 Ang1-7含量,具體操作根據(jù)的 ELISA 試劑盒說明書進行。

1.6 肝線粒體相關基因mRNA表達的檢測

1.6.1 引物設計 大鼠過氧化物酶體增殖物受體共激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子 1(Nrf1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子(Tfam)、泛醌氧化還原酶亞基B8(NDUFB8;compleⅠ)、琥珀酸脫氫酶B(SDHB;complex Ⅱ)、泛醇-細胞色素C還原酶核心蛋白2(UQCRC2;complex Ⅲ)及內(nèi)參GAPDH的引物序列從NCBI網(wǎng)站查閱,根據(jù)引物設計原則,利用Primer Premier 5.0設計引物,引物送由南京擎科生物公司合成,各基因的引物序列見表2。

表2 基因引物序列及參數(shù)Table 2 Sequence and parameters of gene primers

1.6.2 肝組織RNA的提取和cDNA的合成 稱取80 mg左右大鼠肝組織,Trizol法提取總RNA,用酶標儀測定RNA的濃度與純度,DEPC水調(diào)整RNA濃度為 500 ng·μL-1,反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL(Evo M-MLV RT Premix 4 μL,總RNA 2 μL,RNase-Free water14 μL),反轉(zhuǎn)錄程序為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 10 min。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA于-20 ℃保存。

1.6.3 Real-time PCR 采用熒光定量PCR SYBR Green染料法對相關基因的mRNA表達進行相對定量分析,反應體系為10 μL(RNase-Free water 3.6 μL,10 μmol·L-1上下游引物各0.2 μL,2X SYBR Green Pro Taq HS Premix 5 μL,cDNA模板1 μL),兩步法PCR反應程序:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因,計算目的基因相對表達量,結果用2-ΔΔCt表示。

1.7 Western blot檢測相關蛋白表達

Western blot檢測參照Wang等[16]的方法稍作改進:稱取約35 mg肝組織剪碎加入500 μL裂解液(RIPA:PMSF=100∶1)勻漿,4 ℃,12 000 r·min-1,離心10 min取上清,獲得總蛋白。BCA法測定蛋白濃度,并統(tǒng)一稀釋為5 μg·μL-1;蛋白上樣量7 μL經(jīng) SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)法(100 V,90 min)轉(zhuǎn)印于PVDF膜上,取出PVDF膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h,隨后加入β-actin (1∶10 000稀釋),ACE2 (1∶3 000稀釋),UCP1(1∶1 500稀釋),Mfn1、OPA1、Fis1、Drp1 (皆為1∶1 000稀釋),在4 ℃孵育過夜,洗膜后加入山羊抗兔 IgG 二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育2 h。用全自動發(fā)光成像系統(tǒng)顯影,拍照保存,Image J軟件分析條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參計算目的蛋白的相對表達量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結 果

2.1 NAFLD模型的建立

結果見圖1,與對照組相比,大鼠飼喂高脂飼料4周后肝組織病理學切片出現(xiàn)明顯脂肪沉積和脂肪變性(紅色箭頭),與朱斌等[15]的研究結果一致,證實NAFLD模型建立成功,可以開展后續(xù)試驗。

圖1 飼喂高脂飼料4周后大鼠肝組織病理學變化(HE)Fig.1 Histopathological changes in rat liver after 4 weeks of feeding high-fat feed (Hematoxylin-eosin staining)

2.2 DIZE對 NAFLD大鼠TG、TC含量的影響

如表3所示,與 CON 組相比,MOD 組大鼠血清中的TG、TC含量均顯著上升(P<0.05)。與 MOD 組相比,DIZE組大鼠血清中的TG、TC含量均顯著下降(P<0.05)。說明DIZE可以顯著抑制高脂飲食引起的血脂含量增加,緩解肝脂代謝紊亂。

表3 DIZE對NAFLD大鼠血清TG、TC含量的影響Table 3 Effects of DIZE on serum TG and TC contents in NAFLD rats mmol·L-1

2.3 DIZE對NAFLD大鼠ACE2蛋白表達和AngⅡ、Ang1-7含量的影響

結果見圖2,與CON組相比,MOD組ACE2蛋白表達極顯著降低(P<0.01),與MOD組相比,DIZE組ACE2蛋白表達極顯著升高(P<0.01);與CON組相比,MOD組AngⅡ含量極顯著升高(P<0.01),Ang1-7含量顯著升高(P<0.05),AngⅡ/Ang1-7比值顯著升高(P<0.05),與MOD組相比,DIZE組AngⅡ含量極顯著降低(P<0.01),Ang1-7含量升高但不顯著(P>0.05),AngⅡ/Ang1-7比值極顯著降低(P<0.01)。提示,DIZE激活ACE2,ACE2降解AngⅡ為Ang1-7。

與對照組相比,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);與模型組相比,#表示差異顯著(P<0.05),##表示差異極顯著(P<0.01),下同Compared with the control group, * means significant difference (P<0.05), ** means extremely significant difference (P<0.01); Compared with high fat group, # means significant difference (P<0.05), ## means extremely significant difference (P<0.01), the same as below圖2 DIZE對大鼠肝組織中ACE2蛋白表達和AngⅡ、Ang1-7含量的影響(n=8)Fig.2 Effects of DIZE on ACE2 protein expression and AngII and Ang1-7 content in rats liver(n=8)

2.4 DIZE對 NAFLD大鼠線粒體生物發(fā)生相關基因mRNA表達的影響

結果見圖3,與CON組相比,MOD組PGC-1α、Nrf1 和Tfam基因mRNA表達水平均極顯著下調(diào)(P<0.01);與MOD組相比,DIZE組PGC-1α、Nrf1基因mRNA表達水平極顯著上調(diào)(P<0.01),Tfam基因mRNA表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)。提示,DIZE通過促進線粒體生物發(fā)生發(fā)揮緩解NAFLD的作用。

圖3 DIZE對大鼠肝組織中線粒體生物發(fā)生相關基因mRNA表達的影響(n=8)Fig.3 Effect of DIZE on mRNA expression of mitochondrial biogenesis related genes in rats liver(n=8)

2.5 DIZE對NAFLD大鼠線粒體融合與分裂相關蛋白表達的影響

結果見圖4,與CON組相比,MOD組線粒體融合蛋白Mfn1表達量顯著降低(P<0.05),OPA1蛋白表達量極顯著降低(P<0.01),與MOD組相比,DIZE組Mfn1 和OPA1蛋白表達量均極顯著升高(P<0.01)。

圖4 DIZE對大鼠肝組織中線粒體融合分裂相關蛋白表達的影響(n=8)Fig.4 Effect of DIZE on expression of mitochondrial fusion and division related proteins in rats liver(n=8)

與CON組相比,MOD組線粒體分裂蛋白Fis1蛋白表達水平極顯著降低(P<0.01),Drp1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),與MOD組相比,DIZE組Fis1、Drp1蛋白表達水平均極顯著升高(P<0.01);提示,高脂飲食不僅抑制線粒體融合蛋白的表達,還抑制線粒體分裂蛋白的表達,同時抑制融合分裂的情況下,線粒體的數(shù)量以及功能都會受到損傷,DIZE同時促進融合與分裂改善線粒體質(zhì)量發(fā)揮作用。

2.6 DIZE對NAFLD大鼠線粒體呼吸鏈復合物基因表達的影響

結果見圖5,與CON組相比,MOD組NDUFB8和UQCRC2基因mRNA表達極顯著下調(diào)(P<0.01);與MOD組相比,DIZE組NDUFB8和UQCRC2基因mRNA表達水平極顯著上調(diào) (P<0.01);呼吸鏈復合物Ⅱ(SDHB)基因mRNA表達水平各組差異均不顯著。提示:DIZE可以通過促進線粒體呼吸鏈復合物基因mRNA表達調(diào)節(jié)能量代謝,改善NAFLD。

圖5 DIZE對大鼠肝臟組織中線粒體呼吸鏈復合物相關蛋白轉(zhuǎn)錄的影響(n=8)Fig.5 Effect of DIZE on trauscription of mitochondrial respiratory chain complex related proteins in rats liver(n=8)

2.7 DIZE對NAFLD大鼠產(chǎn)熱的影響

結果見圖6,與CON組相比,MOD組UCP1蛋白表達極顯著降低(P<0.01),與MOD組相比,DIZE組UCP1蛋白表達極顯著升高(P<0.01)。提示DIZE可以通過促進產(chǎn)熱促進能量代謝。

圖6 DIZE對大鼠肝組織中UCP1蛋白表達的影響(n=8)Fig.6 Effect of DIZE on UCP1 protein expression in rats liver(n=8)

3 討 論

3.1 DIZE對NAFLD大鼠脂肪沉積的影響

NAFLD以三酰甘油(TG)顯著積累為特征,通常超過肝臟質(zhì)量的5%～10%,其發(fā)生發(fā)展受遺傳、生活習慣、環(huán)境等因素影響, 并且與肥胖、糖尿病等疾病密切相關[17]。高脂飲食可導致三酰甘油異常蓄積和肝線粒體功能失衡[18]。

2016年,Cao等[9]研究表明ACE2/Ang1-7/Mas軸可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝基因減少肝脂積累。Feltenberger等[19]研究表明,上調(diào)MasR或Ang1-7給藥可以降低TG水平,減少脂肪生成相關標志物,改善NAFLD。Ntouma等[20]研究表明,ACE2過表達能夠能緩解肝特異性線粒體應激UBL-5基因缺失導致的脂肪肝。本課題組此前在3T3-L1脂肪細胞的研究提示,ACE2或DIZE可作為防控脂肪沉積發(fā)生和發(fā)展的潛在靶點或藥物[21]。本研究通過建立NAFLD模型,檢測TG、TC含量,AngⅡ/Ang1-7比值以及ACE2蛋白表達,發(fā)現(xiàn)灌胃DIZE可激活ACE2,顯著降低高脂飼喂引起的TG、TC含量的升高,調(diào)節(jié)AngⅡ/Ang1-7比值,緩解肝脂肪沉積,結果與上述研究一致。

3.2 DIZE對NAFLD大鼠線粒體質(zhì)量的影響

線粒體是細胞內(nèi)的一種形態(tài)微小而高度動態(tài)的細胞器,它由線粒體外膜、線粒體膜間間隙、線粒體內(nèi)膜和線粒體基質(zhì)組成。線粒體通過增殖和系統(tǒng)合成維持細胞的生命活動,線粒體還參與細胞信息傳遞、Ca2+穩(wěn)態(tài)、細胞周期調(diào)節(jié)和氧化應激等一系列作用[22]。

線粒體質(zhì)量是一個動態(tài)平衡的過程,線粒體通過自身持續(xù)的融合與分裂、合成與自噬,能夠維持其在細胞內(nèi)的形態(tài)和功能,并提供能量[23]。與線粒體融合相關的主要是線粒體融合蛋白1(Mfn1)、線粒體融合蛋白2(Mfn2)和視神經(jīng)萎縮蛋白1(OPA1)3種蛋白質(zhì),研究表明,線粒體融合蛋白Mfn1與 Mfn2 形成復合體,繼而啟動外膜融合過程[24]。融合蛋白Opa1通過調(diào)節(jié)內(nèi)膜融合維持線粒體嵴的穩(wěn)定性,通過調(diào)控線粒體內(nèi)膜重構,保持呼吸鏈完整[25]。與線粒體分裂相關的主要是動力相關蛋白1(Drp1)、線粒體裂變蛋白1(Fis1)和線粒體分裂因子(MFF)。Drp1廣泛存在于細胞質(zhì)中,經(jīng)翻譯修飾激活后易位至線粒體外膜,并與Fis1、MFF、線粒體動力學蛋白相互作用,收縮并切割線粒體。Fis1、MFF在線粒體裂變過程中扮演了不同的角色。普遍認為,Fis1是介導線粒體碎片化過程中不可缺少的因素[26]。

過氧化物酶體增殖物受體共激活因子-1α(PGC-1α)是哺乳動物線粒體生成的關鍵調(diào)控因子,通過核呼吸因子1和2(Nrf1,Nrf2)調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄因子(Tfam)的表達,進而參與維持線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)轉(zhuǎn)錄和復制,調(diào)控線粒體生成[27-29]。本研究檢測了線粒體融合分裂蛋白的表達及線粒體生物發(fā)生相關基因過氧化物酶體增殖物受體共激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子 1(Nrf1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子(Tfam)、泛醌氧化還原酶亞基B8(NDUFB8;compleⅠ)、琥珀酸脫氫酶B(SDHB;complex Ⅱ)、泛醇-細胞色素C還原酶核心蛋白2(UQCRC2;complex Ⅲ)mRNA表達水平,結果顯示,高脂飲食可以抑制線粒體融合分裂蛋白的表達,線粒體生物發(fā)生基因的表達,導致線粒體動力學失衡,結構破壞以及數(shù)量減少,灌胃DIZE后能夠促進線粒體融合與分裂改善線粒體動力學失衡,促進線粒體生物發(fā)生,進而發(fā)揮緩解NAFLD的作用。

3.3 DIZE對NAFLD大鼠線粒體呼吸鏈和產(chǎn)熱的影響

線粒體是脂肪酸β氧化和能量產(chǎn)生的主要細胞器[30]。呼吸鏈位于線粒體內(nèi)膜,由復合物 I～Ⅳ構成,在線粒體氧化中起關鍵作用[31],呼吸鏈進行一系列的氧化還原反應將電子逐級傳遞到 O2,形成水和 ATP,為機體提供能量。當機體攝入營養(yǎng)物質(zhì)過多時,線粒體呼吸鏈酶復合體的活性降低,導致電子傳遞受阻,ATP耗竭,不能為細胞提供必需的能量。

PGC-1α能夠與UCP1啟動子區(qū)域結合,上調(diào)UCP1表達,促進產(chǎn)熱[32]。Garcia-Berumenci等[33]研究表明,高脂高糖誘導的NAFLD大鼠體內(nèi),復合體I活性降低和ROS的產(chǎn)生增加,會進一步加重肝細胞損傷程度。研究表明,過表達MasR可顯著上調(diào)線粒體呼吸鏈相關蛋白的表達,維持肝能量穩(wěn)態(tài),并改善線粒體功能障礙[7]。Ang II誘導線粒體功能障礙,通過線粒體呼吸鏈復合物I和III促進線粒體中ROS的產(chǎn)生[34]。

本研究檢測了呼吸鏈復合物Ⅰ～Ⅲ mRNA表達水平以及UCP1蛋白表達水平,結果表明,高脂飲食導致線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ和Ⅲ基因mRNA表達水平下調(diào),UCP1蛋白表達水平極顯著降低,灌胃DIZE后可改善這一結果。提示,DIZE通過促進產(chǎn)熱,上調(diào)線粒體呼吸鏈復合物基因mRNA表達水平進而促進能量代謝,緩解NAFLD。

4 結 論

DIZE激活ACE2的表達,調(diào)節(jié)AngⅡ/Ang1-7的比值,同時改善高脂飲食造成的線粒體的生物發(fā)生和線粒體呼吸鏈及產(chǎn)熱等的損傷,繼而減少脂肪沉積發(fā)揮治療非酒精性脂肪肝的作用,其中ACE2與線粒體結構功能之間的具體作用機制,有待進一步研究。