利用牛乳腺細胞和小鼠乳腺組織分析異綠原酸C通過NF-κB信號通路對乳腺炎癥反應的抑制效應

陳喜宏,路桂聰,王浩磊,茍少校,玉永雄,林 濤,2*,蔣曹德*

(1.西南大學動物科學技術學院 重慶市食草動物資源保護與利用工程技術研究中心,重慶 400715;2.廣安市飼料工業管理站,廣安 638000)

奶牛乳腺炎又稱乳房炎(mastitis),是奶牛養殖過程中一種常見且危害嚴重的炎性疾病。奶牛乳房炎會減少奶牛泌乳量、降低乳產品質量、增加奶牛淘汰率,造成養殖場的經濟損失上升[1]。奶牛乳房炎主要分為隱性和臨床乳房炎。奶牛乳房炎主要由病原微生物引起,主要的病原菌包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌等。此外,布氏桿菌可能造成全身性感染而導致奶牛乳房病變[2]。研究發現,由大腸桿菌引起的奶牛乳房炎會從血液中調動白細胞進入乳腺,使臨床型的乳腺炎發病風險增加[3]。

目前國內外對于奶牛乳房炎的治療主要采用抗生素療法。抗生素在乳房炎發生初期可以有效殺死病原菌,特別是急性臨床型乳房炎。但是,抗生素的大量使用會導致動物機體產生副作用,如機體免疫機能下降、胃腸道菌群紊亂等[4]。此外,抗生素會導致病原菌產生耐藥性,奶牛乳汁也會殘留抗生素危害人類健康。植物提取物具有安全性高、無藥物殘留和無耐藥性等優點,可以改善動物機體的免疫力,因此被廣泛應用于畜禽飼料添加劑[5]。因此,研究植物提取物的抗炎作用,對于篩選奶牛乳房炎的抗生素替代防治方法具有重要的理論和實踐意義[6]。

研究發現,異綠原酸(isochlorogenic acid, ICA)具有抗氧化、心血管保護、抗菌、抗病毒、降糖、保護肝、抗炎和神經保護等多種藥理作用[7]。ICA最初于1950年從咖啡提取物中分離出來,現發現于茶、蔬菜和中藥材等多種天然植物中[7]。ICA是一種由一分子奎寧酸和兩分子咖啡酸組成的多酚類物質——雙咖啡酰奎寧酸,有異綠原酸A、B和C(ICAA、ICAB、ICAC)三種異構體[7]。茶葉、西紅柿和甘薯的相關研究揭示了ICAA為抗氧化劑和醛糖還原酶抑制劑[8-10]。Wang等[9]報道ICA抑制了LPS(lipopolysaccharide)誘導的RAW 264.7細胞中NO的水平;體內試驗證實,異綠原酸A對膠原蛋白誘導關節炎小鼠模型有較好的抗炎作用,劑量依賴性地逆轉了LPS誘導的超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、白介素6 (IL-6)、IL-1β水平[11-12];其他研究進一步證實了ICAA通過NF-κB (nuclear factor kappa B)/NLRP3 (NLR family pyrin domain containing 3)通路抑制LPS誘導的小鼠急性肺炎[13-14]。迄今為止發表的文獻集中在ICAA藥代動力學研究以及在小鼠模型中ICAA、ICAB抗氧化和抗炎作用,但是ICAC的相關功能以及ICA對牛奶乳腺炎抑制作用很少有研究報道。

NF-κB是經典的炎性反應通路[15],NF-κB信號通路在炎癥反應中的重要作用已在小鼠乳腺上皮細胞[16-19]、RAW264.7細胞[20-21]、BV-2細胞[22]中得到廣泛證實。因此,本研究選擇牛乳腺上皮細胞MAC-T,采用LPS誘導MAC-T細胞建立炎癥模型,分析ICAC對炎癥因子和NF-κB通路關鍵成員的表達及其活性的調控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

在25 cm2培養瓶內,將MAC-T細胞(BMCC,CHN)培養于5% CO2、37 ℃培養箱(Forma Series 3 WJ, Thermo, USA)。細胞培養采用DMEM基礎培養液,加入10% FBS(Gibco, AUS)、1%青鏈霉素(Solarbio, CHN)和100 mg·L-1的鏈霉素(Solarbio, CHN)。當細胞貼壁生長到90%時用0.25%胰酶(Solarbio, CHN)消化并傳代。

1.2 細胞活性檢測

MAC-T細胞按照2×106個·孔-1的濃度接種在6孔板中,待其貼壁后添加不同濃度的ICAC(0、20、40、60、80、100、120、160 mg·L-1),并設置5個重復。處理細胞24 h后,吸棄上清,加入10 μL MTT(Solarbio, CHN)和90 μL DMEM基礎培養液,繼續培養4 h。培養結束后,棄去培養液,再加入110 μL Formazan(Solarbio,CHN)共育10 min,光密度計(Multiskan GO, Thermo, USA)檢測490 nm處的光密度(OD),并計算處理組相對對照組的細胞活性。細胞活性 =(處理組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3 動物試驗

選取50只(30只雌鼠和20只公鼠)6～8周齡的BALB/c小鼠(伯恩斯韋爾生物技術有限公司,重慶),母鼠每籠2只,公鼠每籠1只,并在無菌環境下飼養1周,自由采食(光照/黑暗各12 h)。1周后,2只母鼠和1只公鼠合1籠進行交配。1周后將公鼠分出,母鼠單籠飼養。母鼠分娩7 d后,將哺乳期母鼠隨機分成6組,每組5只,各組分別為空白對照組、LPS組、LPS+DEX(dexamethasone)(Macklin,CHN)[23]、LPS+ICAC(60 mg·kg-1)、LPS+ICAC(80 mg·kg-1)、LPS+ICAC(100 mg·kg-1)組[16]。LPS(200 mg·L-1,50 μL)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中,用2 mL注射器(6號針頭)注射到每只哺乳期母鼠最容易觀察和采集的第四對乳頭(R4和L4)的乳腺導管中[24]。ICAC處理組的每只哺乳期母鼠用9 μL 4%水合氯醛深度麻醉,在LPS滴注前1 h腹腔注射不同濃度ICAC(60、80、100 mg·kg-1),空白對照組和LPS組腹腔注射等體積的PBS,DEX組注射0.5 mg·kg-1的DEX[24]。注射LPS 24 h后,通過頸椎脫臼處死小鼠,收集乳腺組織,一部分儲存在-80 ℃,另一部分存放于4%多聚甲醛組織固定液里。

1.4 炎癥因子表達水平檢測

MAC-T細胞按照2×106個·孔-1接種于6孔板中待其貼壁,隨后培養在含有不同濃度ICAC(0、20、50、80 mg·L-1)和1 mg·L-1LPS的培養液中,并設置未處理和20 mg·L-1的DEX處理對照[24]。24 h后收集細胞上清液,按照IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS ELISA試劑盒說明書(重慶博諾恒生物科技有限公司)測定各炎性因子的濃度。

1.5 Western blot分析

上述“1.4”培養的細胞采用細胞總蛋白提取試劑盒(Solarbio,CHN)提取總蛋白,隨后用BCA蛋白定量試劑盒(Vazyme,CHN)進行總蛋白定量。取16 μL蛋白樣品,加入4 μL上樣緩沖液(Solarbio,CHN)后煮沸5 min使蛋白變性,采用10% SDS-PAGE電泳(PowerPac HC,Bio-rad,USA)。電泳條帶通過轉印設備(1703812,Bio-rad,USA)轉移到PVDF膜(Biosharp,CHN),在含有5%牛血清白蛋白(Biotopped,CHN)的封閉液中室溫封閉1 h(磷酸化蛋白封閉4 h),進一步與一抗4 ℃孵育過夜,其中一抗包括β-actin(bsm-33036M;稀釋比1∶10 000)、p65(bs-23217R,稀釋比1∶1 000)、磷酸化p65(p-p65)(bs-0982R,稀釋比1∶1 000)、IκBα(bs-1287R,稀釋比1∶1 000)、磷酸化IκB(p-IκB)(bs-2513R,稀釋比1∶1 000)。將上述一抗雜交膜使用TBST洗滌(6 min,5次),隨后與二抗Goat Anti-rabbit IgG/HRP(AB501-01A,Novoprotein,CHN)室溫孵育1 h。孵育結束后,使用ECL化學發光系統(Gel Doc XR,Bio-Rad,USA)檢測目標條帶,并使用Image Lab(version 5.2.1, Bio-Rad, USA)和GraphPad Prism(version 8.2)進行定量分析。每個試驗設置3個重復,以20 mg·L-1DEX和1 mg·L-1LPS共處理作為陽性對照。

1.6 p65核轉移免疫熒光檢測

MAC-T細胞培養在96孔板至90%融合,將細胞分為6組:空白對照組、LPS組、LPS+DEX組、LPS+ICAC(20、50、80 mg·L-1),按照Beyotime試劑盒說明書進行操作。

1.7 乳腺組織免疫組織化學試驗

將處理好的乳腺組織在甲醇中脫水,隨后使用石蠟包埋,制作成5 μm石蠟切片,將CD3抗體(Abcam,稀釋比1∶150)與石蠟切片一起放入4 ℃孵育過夜。用PBS洗滌3次,在室溫下與Goat Anti-rabbit IgG/HRP(AB501-01A,Novoprotein,CHN)在室溫下孵育1 h,通過DAB染色將信號可視化,蘇木精進行細胞核染后在光學顯微鏡下進行拍照。

1.8 數據分析

利用SPSS 19.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA),多重比較采用Duncan’s法,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 ICAC對MAC-T細胞活性的影響

采用不同濃度ICAC處理MAC-T細胞,檢測ICAC對MAC-T細胞活性的影響(圖1)。與對照組相比,濃度為20、40、60、80和100 mg·L-1的ICAC對MAC-T細胞活性均沒有顯著影響(P>0.05)。當ICAC濃度大于120 mg·L-1時,與對照組相比,MAC-T細胞的活性顯著降低(P<0.05)。因此,選用20、50、80 mg·L-1的ICAC處理MAC-T細胞進行下一步研究。

柱形圖上相同小寫字母表示P>0.05,不同小寫字母表示P<0.05(下同)The same lowercase letters above the bars indicate P>0.05, and different lowercase letters mean P<0.05 (the same below)圖1 不同濃度的ICAC處理對MAC-T細胞活性的影響Fig.1 Effects of ICAC treatment with different concentrations on the activity of MAC-T cells

2.2 ICAC對LPS誘導的MAC-T炎癥反應與氧化應激的抑制

采用不同濃度的ICAC和 LPS共處理MAC-T細胞,檢測ICAC對炎性與氧化應激因子的表達(圖2)。與空白對照組相比,LPS處理組炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白質水平極顯著增加(P<0.01),氧化應激因子COX-2和iNOS的表達量也極顯著上調(P<0.01)。與LPS處理組相比,20、50、80 mg·L-1ICAC處理組IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS的表達量極顯著下調(P<0.01)。

與空白對照相比,柱形圖上##表示P<0.01;與LPS處理組相比,*和**分別表示P<0.05和P<0.01,下同Compared with the blank control, ## on the bar chart represents P<0.01; compared with LPS treatment group, * and ** represent P<0.05 and P<0.01, respectively, the same as below圖2 ICAC對LPS誘導的炎性因子表達的影響Fig.2 Effect of ICAC on LPS-induced expression of inflammatory factors

2.3 ICAC對MAC-T細胞NF-κB信號通路的抑制

利用Western blot檢測ICAC對NF-κB信號通路關鍵蛋白(p65和IκB)磷酸化水平的影響(圖3)。與空白對照組相比,LPS處理后p65和IκB的蛋白質水平沒有顯著差異(P>0.05,圖3A～C),但是p-p65和p-IκB水平顯著上升(P<0.05)(圖3D)。相反,20、50和80 mg·L-1ICAC處理顯著降低了LPS誘導的p-p65和p-IκB水平(P<0.05),且ICAC處理組p-p65水平顯著低于DEX處理組(P<0.05)。

進一步利用免疫熒光方法觀察p65核轉移情況。圖4A顯示,在空白對照組中p65(紅色熒光)分散在細胞中,但是在LPS處理組中p65大量向細胞核(藍色熒光)聚集;與LPS處理組相比,DEX和ICAC處理組(20、50、80 mg·L-1)的細胞核紅色熒光聚集較少。圖4B結果進一步證實LPS處理組的細胞核p65蛋白質水平相對于空白對照組極顯著上升(P<0.01);與LPS組相比,DEX組和ICAC處理組(20、50、80 mg·L-1)細胞核p65極顯著下降(P<0.01)。

A.p65核轉移免疫熒光檢測(細胞核標記為藍色熒光,p65蛋白標記為紅色熒光);B.細胞核p65蛋白質相對β-actin的含量A. Immunofluorescence of p65 nuclear transfer. The nucleus was labeled with blue fluorescence, while p65 proteins were labeled with red fluorescence. B. Nuclear p65 protein content relative to β-actin圖4 ICAC對LPS誘導的p65核轉移的抑制Fig.4 Inhibition of LPS-induced p65 nuclear transfer by ICAC

2.4 ICAC對LPS誘導小鼠乳腺炎癥的抑制

采用組織免疫組化方法體內證實ICAC對LPS誘導的小鼠乳房炎癥的保護作用。如圖5所示,空白對照組的乳腺組織形態表現正常,LPS處理組中的T細胞標記物CD3明顯增多,表明乳腺組織T淋巴細胞浸潤增多。與LPS處理組相比,DEX對照組與ICAC處理組的小鼠乳腺組織的T淋巴細胞浸潤明顯減少,且ICAC處理組比DEX組效果更明顯。

圖5 小鼠乳腺組織CD3免疫組織化學染色(400×)Fig.5 Immunohistochemical staining (400×) of CD3 in mouse mammary gland tissues

2.5 ICAC對小鼠乳腺組織NF-κB信號通路的抑制

利用Western blot檢測小鼠乳腺組織中ICAC對NF-κB信號通路關鍵成員p65和IκB的磷酸化影響(圖6)。與對照組相比,LPS處理后p65和IκB蛋白表達顯著上調(P<0.05,圖6B～C),但是60、80和100 mg·kg-1的 ICAC處理均顯著下調了LPS誘導的p65和IκB的表達(P<0.05),而且ICAC處理組中兩種蛋白的表達量也顯著低于DEX處理組(P<0.05)。同樣,ICAC的處理也顯著降低了p-p65和p-IκB蛋白質水平(P<0.05,圖6D～F)。

A. p65和IκB的Western blot條帶;B、C. p65和IκB相對β-actin的表達量;D. p-p65和p-IκB的Western blot條帶;E、F. p-p65和p-IκB相對β-actin的表達量A. Western blotting for p65 and IκB; B, C. p65/β-actin and IκB/β-actin ratio, respectively; D. Western blotting for p-p65 and p-IκB; E, F. p-p65/β-actin and p-IκB/β-actin ratio, respectively圖6 ICAC對小鼠乳腺組織NF-κB通路的影響Fig.6 Effect of ICAC on NF-κB pathway in mouse mammary gland tissue

3 討 論

臨床型牛乳腺炎主要由細菌感染引起奶牛局部以及全身炎癥,最常見的病原體是金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。大腸桿菌引發的急性臨床癥狀,使機體產生免疫應答和免疫損傷效應,包括細胞因子和趨化因子的表達[25]。LPS是大腸桿菌細胞壁的主要組成成分,通過TLR4/NF-κB級聯激活引起炎癥反應[26]。另一方面,MAC-T細胞是通過轉染猴病毒-40的大T抗原后從牛乳腺上皮細胞中分離出來的;由于MAC-T與原代細胞具有相似的生物學反應,經常被用來作為牛乳腺炎的炎癥模型[27]。因此,本研究根據前期研究采用1 mg·L-1的LPS刺激MAC-T細胞炎性反應;通過篩選ICAC處理濃度(圖1),選擇20、50、80 mg·L-1的ICAC探究其對MAC-T細胞炎性反應的影響。

先前的研究證明了細胞因子在細菌病原體促進細胞炎癥反應中的重要作用[27]。LPS誘導的促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β對牛乳腺組織造成嚴重損傷,ICA減輕小鼠自身免疫性關節炎和RAW264.7巨噬細胞中的炎癥[13-14,16]。本研究發現,ICAC降低了LPS誘導的IL-1β和IL-6的表達量,并且ICAC還抑制了炎癥介導因子COX-2和iNOS的表達(圖2),證明了ICAC可以減輕LPS誘導的MAC-T細胞的炎癥反應。COX-2是一種誘導酶,在炎癥反應過程中表達量上調,并且誘導PGE2的表達[28];iNOS主要在巨噬細胞和白細胞內表達,在炎癥反應中,iNOS促進釋放NO[29-31],說明COX-2和iNOS介導炎癥的發生,它們的表達與氧化應激密切相關[15,32]。近期的研究進一步證實ICAC降低EV71感染小鼠腦部IL-6和TNF-α表示水平以及 GSH/GSSG比值和活性氧水平[33];ICAC抑制了高脂肪日糧小鼠巨噬細胞中iNOS, COX2和IL-1β的表達[34]。上述結果證明ICAC具有抗氧化應急和抗炎性反應的作用。

NF-κB是LPS誘導炎癥過程中經典的信號傳導路徑,許多植物提取物是通過阻斷NF-κB信號傳導途徑來抑制炎癥反應[35-37]。NF-κB是細胞中廣泛存在的轉錄因子。在靜息狀態下,位于細胞質中的NF-κB與IκB結合而處于無活性狀態[38]。LPS刺激產生IκBα和p65磷酸化,p-IκBα通過泛素化被降解,釋放出p-p65遷移到細胞核啟動COX-2、TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性因子基因的轉錄[33]。本研究的體內與體外實驗結果均表明,ICAC處理降低p-p65和p-IκB的水平,尤其降低p-p65在細胞核內的含量。免疫組化試驗進一步發現,ICAC處理后LPS引起的小鼠乳腺組織T淋巴細胞浸潤明顯減輕。近期的研究也指出,異綠原酸的抗炎機制與抑制NLRP3炎性復合體的形成和NF-κB磷酸化有關[37]。綜上,ICAC通過抑制IκB和p65磷酸化從而抑制LPS誘導MAC-T細胞和小鼠乳腺炎性反應。

4 結 論

本研究表明,ICAC能降低LPS誘導的MAC-T細胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和炎癥介導因子COX-2和iNOS的表達;ICAC通過抑制NF-κB信號通路抑制MAC-T細胞和小鼠乳腺炎癥反應,但是異綠原酸C在奶牛乳腺炎防治中的應用有待進一步研究。