奶水牛發情標記物的研究進展

余 洲,楊柏高,張 航,徐 茜,張培培,馮肖藝,曹建華,牛一凡,杜衛華,郝海生,朱化彬,阿布力孜·吾斯曼,趙學明*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193;2.新疆農業大學動物科學學院,烏魯木齊 830052)

隨著我國經濟實力不斷提升,人均可支配收入隨之增加,人們對于綠色、自然、健康的食品也有了更高的需求。水牛奶中鈣、磷、鐵含量高,微量元素均衡,營養全面,被譽為“奶中之王”,水牛奶產品在世界奶類市場占比中逐年升高,擁有巨大消費市場[1]。水牛具有耐高溫高濕、耐粗飼以及抗病能力強等優良特性,其奶產品質優且經濟價值高,因此,水牛被聯合國糧食及農業組織認定為最具開發潛力和開發價值的家畜[2]。我國本土水牛為役用的沼澤型水牛,國外主要為奶用的河流型水牛,為了提高我國水牛的生產性能,于1957年和1974年從印度和巴基斯坦引進了摩拉水牛和尼里-拉菲水牛,并與我國本土水牛進行雜交,經過長時間的改良工作,已使得我國雜交水牛的乳、肉生產性能得到了大幅提高[3]。

然而,在現代化規模養殖中,水牛發情不明顯的問題日益突出。研究表明,在夏季水牛發情鑒定過程中,安靜發情的水牛占到了總數的29%,這極大降低了水牛的發情鑒定效率[4]。此外,由于高精度發情檢測手段的缺乏,50%的水牛發情無法及時檢出,從而導致無法及時實施配種計劃[5]。在生產實踐中,約有20%的配種母牛因授精時間不當而無法成功受孕,這極大地降低了牛群的整體生產力,并對水牛產業造成了沉重的經濟負擔[6]。據報道,在生產中,因奶水牛發情問題導致的日均損失可達每頭6美元[7]。因此,精準的發情鑒定對于奶水牛生產愈發重要。利用發情鑒定可以準確的鑒別水牛的發情時期,提前計劃配種時間,擇優劣汰,從而提高水牛的繁殖性能,使生產的經濟效益最大化。

牛的發情階段分為:發情前期、發情期、發情后期和發情間期。目前,根據發情周期已開發出多種發情鑒定方法,包括人工觀察法、人工涂蠟法和自動化監測法等。人工自然觀察法較為簡單,母牛發情前期會出現頻繁走動、長時間處于站立狀態、與其余牛只貼靠等行為,發情中期接受爬跨,或出現舉尾躬腰體態,到發情后期時,母牛拒絕爬跨;此法簡單直接但易漏檢、誤檢,當母牛的發情期集中于晚上時不易發現,且當母?？倲递^多時費時費力[8-9]。人工涂蠟法是通過對發情母牛的尾椎使用蠟筆標記,經過爬跨的母牛后背的涂料會變淺,從而確定母牛是否發情,但是當牛被毛被舔舐或下雨天氣時該方法失效[8]。自動化監測法有常見的計步器和其他智能檢測設備,計步器檢測法的準確率在75%～90%之間,但無法區別假發情與安靜發情[10]。其他智檢設備包括智能耳標[11]、項圈[12]、電子鼻[13]和背景差分技術[14]等,能對采食、反芻和趴窩等綜合行為進行發情檢測,可以克服一些傳統視覺發情檢測方法的局限性,但設備和服務的高投入影響其大規模應用[15]。以上方法尚不能滿足奶水牛規?；a發情鑒定的需求,亟待開發操作簡單、成本更低、精度更高的發情監測手段。

最近的研究表明,血液[16]、尿液[17]、唾液[18]和宮頸陰道液(cervical-vaginal fluid, CVF)[19]等各種體液及糞便中生物分子表達差異成為母畜發情診斷的重要靶標[20]。通過體液及糞便進行發情鑒定具有準確、及時、簡單、成本低等優點,符合生產實際的現狀,并且使用該方法可以提高經濟效益[21-22]。本文針對奶水牛該領域的研究進行了總結和回顧,旨在為開發奶水牛發情鑒定新方法提供技術參考。

1 血液鑒定發情

1.1 促黃體生成素

發情周期內各生殖激素濃度的變化一直是發情鑒定的研究熱點。促黃體生成素(luteinizing hormone, LH)為糖蛋白激素中的一種,其不僅促進卵泡成熟至排出,還促進卵泡排出后的一系列顆粒細胞黃體化以及保持黃體孕酮分泌,刺激卵泡膜細胞分泌雄激素[23]。在一項研究中,通過檢測水牛發情周期中的血清LH濃度,發現在發情當天濃度最高[24]。Niswender等[25]報道,發情當天的綿羊血清LH含量高于卵泡期和黃體期。而在一項對巴美肉羊的研究中,發現血清 LH呈脈沖式分泌,在發情期時含量最高[26]。

1.2 促卵泡素

促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH),與LH一樣是糖蛋白類激素,主要由腺垂體分泌[23]。FSH對雌性動物個體生長發育、卵泡內膜細胞分化、顆粒細胞增生和卵泡液分泌起促進作用,并在LH協作下可刺激卵泡的成熟與排出[23]。在一項研究中,通過檢測水牛發情周期血清FSH濃度,發現在發情當天濃度最高[24]。Akbar等[27]報道,發情當天的牛血清FSH水平高于卵泡期和黃體期。而在一項對巴美肉羊的研究中,發現血清 FSH也呈脈沖式分泌,在發情期時含量最高[26]。

1.3 孕酮

孕酮主要由卵巢內的黃體分泌,隨著牛發情周期規律性變化。據報道,水牛血清孕酮濃度在發情當天達到最低值[28]。Smith等[29]研究發現,奶牛的血漿孕酮濃度在發情時濃度最低,低濃度會從發情前4 d一直持續到發情后4 d。另一項研究顯示,通過檢測血清孕酮水平,可有效鑒別同期發情處理母牛的假性發情,提高克隆胚胎移植妊娠率[30]。因此,可以通過檢測水牛血清孕酮濃度來鑒定其是否發情。

1.4 miRNAs

miRNAs是一種內源性小RNA,它們通過與mRNA非編碼區結合位點的堿基互補配對方式,從而調控靶基因的降解或抑制轉錄后翻譯過程,以實現對基因表達的調節[31]。miRNAs在發情周期的牛卵巢組織中有周期性表達,它們在發情周期的不同階段具有特定的作用[32-33]。在一項研究中,研究者將miRNAs測序和實時熒光定量PCR相結合,確定了在牛發情周期期間血漿中水平發生變化的miRNAs子集,發現在發情期let-7f、miR-125b、miR-99a-5p和miR-145的水平顯著升高[34]。Ioannidis和Donadeu等[16]針對奶牛的血漿進行了相關研究,表明與奶牛發情周期的其他階段相比,發情期 miR-99a-5p、let-7f、miR-145 和 miR-125b 的水平顯著增加。另一項研究表明,血清miR-126-3p水平在排卵期和黃體期均高于卵泡期,且與雌二醇(estradiol, E2)值呈正相關[35]。

2 尿液鑒定發情

哺乳動物能通過尿液、唾液、糞便和一些特殊的氣味腺體向外部環境排泄化學信號,這些信號的濃度可能會隨著動物的階段和狀態而變化,在交流的各種來源中,尿液是參與信號-受體系統的主要來源之一[36-37]。

2.1 揮發性化合物

根據相關研究證明,在有蹄類動物中,尿液和CVF中含有發情期指示信息素,這些信息素首先引起性嗅反應,隨后會導致行為的增加[38]。信息素釋放的時機通常對物種同期生殖行為至關重要,在亞洲母象發情期時(排卵之前)會釋放一種尿性信息素,這些信息素會使公象因為化學反應而出現性嗅反射[39]。Rajanarayanan和Archunan[17]在母水牛尿液中鑒定出了14種不同的揮發性化合物,其中1-氯辛烷、4-甲基苯酚和9-十八碳烯酸僅在發情期出現。因此,可從奶水牛尿液成分開發發情鑒定標記物。

2.2 miRNAs

在一項研究中評估了各種miRNAs,發現發情期水牛尿液中的miR-99a-5p和BTA-miR-125b水平低于發情前期和發情間期[40]。Ioannidis和Donadeu等[16]發現,miR-99a-5p 和BTA-miR-125b在奶牛的卵泡期卵巢中表達較高,在發情期血漿水平較高。

2.3 LH

一些研究證明,用于檢測血液LH的抗體在檢測其他物種的純凈尿液LH時,同樣會出現LH顯著增加的現象[41]。在水牛尿液中檢測到的LH濃度高于血清的LH,且據分析,發情期尿液中的LH與基礎值相比顯著增加了一倍,但發情前和發情后的尿液中LH并沒有顯著增加[42]。

3 CVF鑒定發情

CVF是來自陰道、宮頸內膜、子宮蛻膜和羊膜分泌物的復雜混合物,具有發出生育信號、幫助授精、懷孕以及分娩等功能,采集相對安全、容易,可能作為妊娠的生物標志物的來源[43]。

3.1 粘液形態

水牛的發情跡象并不明顯,尤其是CVF的分泌[17]。水牛發情期和發情間期的CVF相比,發情期的粘液量多、稀薄、清澈,而在發情間期,粘液稀少但濃稠[44]。然而,在發情期的整個過程中,外陰腫脹和CVF結晶的情況則十分明顯[45]。此外,牛的CVF在不同發情時期表現出的不同結晶模式(圖1)也可以作為發情鑒定的手段,這個結晶模式取決于雌激素和孕酮的濃度[46]。

a. 發情期晶體緊密且連續的葉狀排列;b. 發情間期結晶不連續a. Compact and continuous leafy arrangement of crystal during the estrus phase; b. Discontinuous crystallization during diestrus圖1 發情期水牛CVF結晶(風干,150×)[19]Fig.1 CVF crystallization of estrus buffalo (air dried, 150×)[19]

3.2 蛋白質組

有研究表明,在水牛整個發情周期的CVF中共鑒定出240種蛋白質,而在發情期只鑒定出176種蛋白質,再次對兩個時期的特定蛋白質進行研究,發現127種蛋白質是發情期特有的,如水牛發情期CVF中的組蛋白H2B,其結果表明發情期CVF比發情間期CVF含有更多的特定蛋白。水牛發情期時,CVF中HSPA1A蛋白的豐度高于發情間期,且HSP-70在發情期會出現高表達[19]。這些CVF的蛋白鑒定可以作為鑒定發情階段的一種有效方式。

4 糞便鑒定發情

糞便是代謝產物從動物體內排出的主要媒介之一,具有潛在的傳達動物內部生理信息的功能,因此成為許多物種獲取化學信號的重要來源之一[47]。據研究表明,無論是小型還是大型哺乳動物,在發情期間,它們的糞便中都會釋放特定的化合物[48]。

牛在發情周期期間其糞便中的揮發性化合物發生顯著變化,在整個發情周期中,檢測到27種化合物,其中4-甲基苯酚和反式馬鞭草酚只存在于發情期,牛糞便中的這兩種化合物可以作為體現發情狀態的標志[47]。而在另一項試驗中,通過對發情前期、發情期和發情后期牛的糞便進行分析檢測到10種不同的揮發性化合物,發現乙酸、丙酸等是發情期特有的,丁酸、羧酸和戊酸等是發情前期特有的,而丁烷等化合物僅存在于發情后期[49]。

5 唾液鑒定發情

唾液主要由腮腺、舌下腺和下頜腺3對唾液腺和口腔粘膜下大量的小唾液腺分泌物產生,主要包括水、一些非蛋白質有機物,以及一些蛋白質或多肽物質,它由淀粉酶、白蛋白、分泌型免疫球蛋白A和富含酪蛋白的蛋白質組成[50]。唾液是動物體內重要和必需的體液,其富含類固醇激素、DNA、高分子敏感性RNA以及氧化應激標志物等成分,人體內的大多數代謝物、激素、抗體和其他物質都可以通過血液的被動擴散或主動運輸進入唾液[51]。唾液相對于其他的體液來說,具有易采集、易處理、成本低、樣品量充足、動物應激小等優點,在發情前期診斷有著非常重要的意義。利用PCR、代謝組、蛋白質組學、色譜-質譜分析及生物學分析等先進技術手段,對家畜不同發情時期的唾液樣本進行分析,尋找家畜在不同發情時期的特異性發情標記物作為分子靶向,可以降低成本且極大的提高家畜發情鑒定效率[20]。

5.1 內源性性激素

在女性的唾液和血液中,E2的含量與卵泡大小和數量成正比,并與卵泡的數量顯著相關。因此,可以通過檢測唾液中E2的含量來反映血漿游離激素水平[52]。在水牛中,血液和唾液的生殖激素水平在發情周期中基本趨于一致,唾液中E2、FSH和LH在發情當天都達到了最高水平[24,53]。

5.2 蛋白質組

Singh等[54]報道,與其他3個發情階段相比,水牛唾液中發情期時ENO3和SDF4的表達增加;SERPINB1在發情前期和發情期的表達顯著,而在發情后期和發情間期的表達幾乎可以忽略不計。一項研究證明,HSPA1A在水牛唾液的發情期出現特異性表達[55]。另一項研究報道,SERPINAI、HSP-70和ANXAI在發情當天表達量增加[53]。此外,據一項水牛唾液直接轉錄分析顯示,發情水牛的HSP-70和TLR4轉錄水平更高[52]。一項關于豬不同發情階段唾液的研究發現,在發情期P00335、P28491、F1SHL9、F1SDR7的表達顯著上調,在發情后期顯著下調,且它們與雌激素含量密切相關[50]。

5.3 miRNAs

水牛唾液中miR-16、miR-191、和miR-233含量與發情周期相關,可以作為水牛發情標記物。據報道,它們在發情期及第9～10天唾液中的含量低于發情周期的其他天數,在研究樣本中發現發情間期和隨后連續發情階段的唾液miR-16、miR-191和miR-223水平高于發情期,表明這3種miRNAs在水牛發情周期的不同階段的唾液中動態存在[56]。

5.4 結晶形態

與CVF一樣,唾液也會在不同的發情時期出現不同的結晶模式,雖然反芻動物唾液結晶模式與生殖狀態有關的信息比較有限,但仍有一些關于牛的研究表明,結晶模式與生殖狀態之間存在顯著的關聯[57-59]。在澤布奶牛中(圖2)發現,發情周期的第20天,所有的奶牛唾液中都觀察到了明顯的蕨類結晶模式[60]。

a. 樹枝狀;b. 蕨類;c. 冷杉類;d. 樹枝和冷杉類;e. 冷杉和蕨類;f. 樹枝和蕨類a. Branch like; b. Fern like; c. Fir like; d. Branch and fir like; e. Fir and fern like; f. Branch and fern like圖2 在奶牛唾液中觀察到的主要結晶模式(風干,200×)[60]Fig.2 Major crystallization patterns observed in saliva of cows (air dried, 200×)[60]

6 小 結

奶水牛是重要的農耕役畜,其優質的奶產品使其在生產上具有廣大的效益前景。然而,奶水牛發情并不明顯,現有發情鑒定技術手段不能滿足生產需求。開發新的奶水牛發情鑒定手段,不僅可以提高水牛的繁殖效率,還可以提高經濟效益。隨著組學技術的發展和應用,可以深入挖掘發情周期的分子變化,挖掘發情標志物為發情鑒定方法研究提供更多可能性,開發出更為簡便、高效、準確的發情檢測試劑盒。