基于代謝組學探討金藤清痹顆粒治療類風濕關節炎的作用機制

趙靈靈，周政，賈文瑞，王娟

（鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052）

類風濕關節炎（RA）是一種常見的全身性自身免疫性炎癥疾病，其臨床特點主要表現為關節疼痛、腫脹，可嚴重損害患者身體功能和生活質量［1］。一項對41個國家的67項RA隊列發病率和患病率研究的薈萃分析發現，1986—2014 年全球RA 的患病率為0.46%（95%CI，0.37%～0.57%））［2］。有報道顯示，目前我國RA 患病率為0.42%，總患病人數已達500 萬［3］。大量的臨床研究表明，與普通人群相比，RA 患者發生嚴重感染、呼吸道疾病、骨質疏松癥、心血管疾病、癌癥和死亡的風險更高［1，4-5］。因此，尋找安全、有效的治療RA藥物具有重要的意義。

金藤清痹顆粒具有清熱解毒、活血消腫、通痹止痛之功，臨床主要用于RA 活動期［6］。目前，有關金藤清痹顆粒治療RA 的基礎研究報道較少，多為臨床療效觀察［7-8］。代謝組學技術因其具有整體性、動態性、高靈敏度和高通量等優勢廣泛應用于生命科學的各個領域，利用現代分析技術定量測定生物體液內源性代謝產物，如脂質、氨基酸和有機物的變化，結合生物信息學闡明內源性小分子代謝物變化規律，為揭示中藥發揮藥效的“多途徑-多靶點”作用機制提供了可能［9-10］。因此，本研究基于代謝組學開展金藤清痹顆粒治療RA的作用機制，為金藤清痹顆粒向臨床進一步深入推廣提供參考和依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級健康SD雄性大鼠30只，來源于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2020－0004），6 周齡，清潔級，體質量（170 ± 10）g，飼養于鄭州大學動物實驗中心，飼養條件為溫度（25 ± 2）℃，相對濕度（45 ± 5）%，12 h 光照條件下飼養7 d 后開始實驗。本實驗取得鄭州大學第一附屬醫院生命科學倫理委員會批準，批準號：K2020－0005。

1.2 藥品

雙氯芬酸鈉（中國希恩思生化科技有限公司，批號：201007）；金藤清痹顆粒（魯南厚普制藥有限公司，批號：28210041）。

1.3 主要試劑與儀器

C 反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、類風濕因子（RF）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號分別為2010－2、2008－2、Z18037186）；牛Ⅱ型膠原蛋白（CⅡ）、弗氏不完全佐劑（IFA）、弗氏完全佐劑（CFA）（Sigma 公司，批號分別為20200235、SLBR0324A、SLBR3879V）；乙腈（Merck 公司，批號：1499230－935）；乙酸銨（Sigma公司，批號：70221）。

色譜柱：Waters， ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm × 100 mm， 1.7 μm）；BX53 型電子顯微鏡、DP72CCD 相機（日本Olympus）；Sunrise 酶標儀（瑞士Teacan 公司）；TGL－16M 型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；DW－HL508 型超低溫冰箱（安徽中科美菱低溫科技股份有限公司）；Leica UC7 型超薄切片機（Leica）；AB Triple TOF 6600質譜儀（AB SCIEX）；Agilent 1290 Infinity LC 超高壓液相色譜儀（Agilent）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及造模

SD 大鼠適應性飼養7 d，依據體質量隨機分為對照組（Control 組）、模型組（Model 組）、雙氯芬酸鈉陽性藥組［SLFSN 組，3 mg/（kg·d）］、金藤清痹顆粒高劑量組［JTQB－H 組，6.30 g/（kg·d）］和金藤清痹顆粒低劑量組［JTQB－L 組，3.15 g/（kg·d）］，每組6 只。Control組和Model 組大鼠灌胃給予生理鹽水，其余組給予相應藥物，給藥周期為28 d。除對照組外，其余各組大鼠參考文獻［11］采用膠原誘導RA 大鼠模型，實驗第1天，多點給予CⅡ 5 mg/mL 與含結核分枝桿菌CFA的混合乳劑注射大鼠尾部和左后足進行初次免疫；實驗第21 天，在大鼠尾根部相同部位多點給予CⅡ與IFA 的混合乳劑加強免疫。對照組在相同實驗周期給予生理鹽水注射。

2.2 取材

末次給藥后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，部分全血置于涂有肝素鈉的EP 管中，其余全血放于普通試管中，3 000 r/min 離心10 min 分離血漿和血清，其中血漿用于代謝組學研究，血清用于檢測TNF－α、IL－1β、RF 水平。處死大鼠后，采用線環繞踝關節方法測量關節的腫脹度，取部分踝關節組織，置于4%多聚甲醛固定用于病理學觀察。

2.3 代謝組學分析

2.3.1 血漿處理

將各組血漿于4 ℃環境解凍后，取適量樣本加入預冷甲醇/乙腈/水溶液（2∶2∶1，V/V），渦旋混合，低溫超聲30 min，-20 ℃靜置10 min，14 000 ×g4 ℃離心20 min，取上清真空干燥，分析時加入100 μL乙腈水溶液（乙腈∶水 = 1∶1，V/V）復溶，渦旋，14 000 ×g4 ℃離心15 min，取上清液進樣分析。

2.3.2 色譜條件

Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色譜系統（UPLC），HILIC 色譜柱進行分離；柱溫25 ℃；流速0.5 mL/min；進樣量2 μL；流動相組成為A：水+25 mmol/L乙酸銨+ 25 mmol/L氨水，B：乙腈。梯度洗脫條件：0→0.5 min，95% B；0.5 min→7 min，95%→65% B；7 min→8 min，65%→40% B；8 min→9 min，40% B；9 min→9.1 min，40%→95% B；9.1 min→12 min，95% B。

2.3.3 質譜條件

采用AB Triple TOF 6600 質譜儀進行樣本一級、二級譜圖的采集。ESI 源條件：Ion Source Gas1：60，Ion Source Gas2：60，Curtain gas：30，IonSapary Voltage Floating：± 5 500 V（正負兩種模式）；TOF MS scan m/z range：60～1 000 Da，product ion scan m/z range：25～1 000 Da；二級質譜采用information dependent acquisition獲取，并且采用high sensitivity 模式，Declustering potential： ± 60 V（正負兩種模式），Collision Energy：（35 ±15）eV。

2.3.4 數據分析

將質譜采集的數據信息導入R 軟件，進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS－DA）。OPLS－DA 模型的變量重要性投影（VIP）初步篩選出各組代謝物，選取VIP > 1.0 且P< 0.05 的變量進行進一步數據分析。

2.3.5 質控

質控樣本（QC）由所有樣本的提取液等體積制備而成，每個QC 的體積與待測樣本分析方法一致，以考察整個檢測過程的穩定性。

2.4 統計學方法

實驗數據用SPSS20.0（IBM， Armonk，USA）統計分析軟件進行處理，先進行方差齊性檢驗，結果用±s表示，兩組間均數比較采用t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠踝關節腫脹度的比較

與Control 組比較，Model 組大鼠踝關節腫脹度顯著升高（P< 0.01），踝關節部位紅腫較嚴重。與Model組比較，SLFSN、JTQB－H、JTQB－L 組大鼠踝關節腫脹度顯著降低（P< 0.05），踝關節部位紅腫明顯減輕。結果見圖1。

圖1 各組大鼠關節腫脹度情況比較

3.2 各組大鼠踝關節病理情況比較

Control 組大鼠踝關節組織結構正常完整，Model組大鼠踝關節內出現明顯的病變和損傷，其中滑膜細胞增生顯著，并伴隨大量炎性細胞浸潤。SLFSN、JTQB－H 和JTQB－L 組踝關節病變和損傷均得到一定改善，其中滑膜細胞出現輕度增生，炎性細胞浸潤有所減少。結果見圖2。

圖2 各組大鼠踝關節HE染色圖（×200）

3.3 各組大鼠血清TNF－α、IL－1β和RF水平比較

與Control組比較，Model組血清IL－1β水平顯著升高（P< 0.01），與Model 組比較，SLFSN、JTQB-H 和JTQB－L組血清IL－1β顯著降低（P< 0.01，P< 0.05）；與Control 組比較，Model 組血清TNF－α 顯著升高（P<0.01），與Model 組比較，SLFSN、JTQB－H 組血清IL－1β 顯著降低（P< 0.01，P< 0.05）；與Control 組比較，Model組血清RF顯著升高（P< 0.01），與Model組比較，SLFSN組血清RF顯著降低（P< 0.05），其余各組均無顯著變化，差異無統計學意義（P> 0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠血清TNF－α、IL－1β和RF水平變化（± s，pg/mL）

表1 各組大鼠血清TNF－α、IL－1β和RF水平變化（± s，pg/mL）

注：與Control 組比較，**P < 0.01；與Model 組比較，△P < 0.05，△△P < 0.01。

組別Control組Model組SLFSN組JTQB－H組JTQB－L組n6 6 6 6 6 TNF－α 123.39 ± 56.29 301.90 ± 53.85**194.88 ± 43.98△△196.54 ± 63.11△220.50 ± 86.99 IL－1β 154.21 ± 23.46 226.56 ± 34.66**156.90 ± 35.64△△167.88 ± 31.35△171.56 ± 45.81△RF 106.73 ± 20.15 179.96 ± 48.98**116.89 ± 13.96△157.71 ± 32.16 172.75 ± 10.78

3.4 各組RA大鼠血漿代謝組學情況比較

病理學觀察和藥效學顯示，JTQB－H 組改善RA大鼠踝關節腫脹度和炎癥狀態、抗炎藥效指標顯示出更好的優勢，因此本研究選擇JTQB－H 組大鼠開展代謝組學相關研究。

3.4.1 QC樣本總離子流圖比較

將QC 樣本總離子流圖進行譜圖重疊比較，結果各色譜峰的響應強度和保留時間基本重疊，說明在整個實驗過程中儀器誤差引起的變異較小。結果見圖3。

圖3 不同離子模式 QC 樣本總離子流圖重疊譜圖

3.4.2 各組樣本代謝輪廓分析

對所得數據使用PCA 分析，結果表明Control 組與Model 組明顯分離，說明CIA 造模成功，給予金藤清痹顆粒后，JTQB－H 組與Model 組分離明顯，且有向Control 組回調趨勢，說明金藤清痹顆粒對RA 模型具有較好的治療作用。結果見圖4。

3.4.3 差異代謝物篩選

基于OPLS－DA進一步對正、負離子模式下Model組和JTQB－H 組所檢測到的所有代謝物進行差異分析，并繪制正、負離子代謝物火山圖。以VIP > 1、P<0.05 作為篩選差異代謝物條件，并結合HMDB、KEGG等數據庫，最終篩選出12 個差異代謝物，其中負離子模式下篩選出4 個差異代謝物，正離子模式下篩選出8個差異代謝物。結果見圖5和表2。

表2 正、負離子模式顯著性差異代謝物

圖5 不同離子模式下Model組和JTQB-H組代謝物火山圖

3.4.4 差異代謝物的相關通路分析

對上述差異代謝物通過KEGG 進行生物途徑富集分析，篩選潛在的關鍵代謝通路，結果提示金藤清痹顆粒主要通過調節甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、亞油酸代謝、苯丙氨酸代謝等通路發揮治療RA 的作用。結果見圖6。

圖6 KEGG富集通路圖

4 討論

研究顯示，RA的早期診斷和治療可以避免或減緩90%的患者關節損傷的進展，從而防止不可逆的殘疾［12］。目前，臨床中常用治療RA 的藥物有抗風濕藥、糖皮質激素、生物制劑等［13-15］，上述藥物可有效減輕RA患者疼痛和腫脹，并改善身體功能和抑制關節結構性損傷進展。但部分藥物會出現一系列的不良反應，嚴重限制了其在臨床中的使用，如抗風濕藥甲氨蝶呤在使用過程中易引起肝、腎毒性、加重感染及胃腸道不適等不良反應［16］；糖皮質激素藥潑尼松龍長期使用易引起多系統代謝紊亂，如骨質疏松癥和胃潰瘍等［17］；生物制劑如腫瘤壞死因子抑制劑會增加老年患者首次住院和心力衰竭加重的風險［18］。因此，對RA 治療藥物的安全性、有效性提出了更高的要求。

金藤清痹顆粒由金銀花、青風藤、白芍、生地黃、白花蛇舌草、當歸、鹿銜草、玄參、蜈蚣和甘草組成，源于清代鮑相璈所編《驗方新編》中的四妙勇安湯［8］。有研究顯示，青風藤中總生物堿可通過降低RA 大鼠關節腫脹，血清中的P－選擇素和血小板內皮細胞黏附因子的表達，從而緩解RA 癥狀［19］。白芍中的白芍總苷可通過降低類風濕因子、C 反應蛋白、調節糞球菌屬Coprococcus 的相對豐度誘導自身免疫耐受和減輕炎癥反應治療RA［20］。白花蛇舌草中的阿魏酸通過抑制血栓素的分泌，下調血管內皮生長因子及軟骨細胞中的基質金屬蛋白酶－3 的表達，進而改善軟骨基質治療RA［21］。鹿銜草可減少炎癥早期的滲出，抑制組織增生和肉芽形成，且能增加胸腺和脾臟重量，提高免疫功能［22］。蜈蚣可明顯減輕治療大鼠炎癥和關節損傷，調節T 淋巴細胞亞群平衡，下調TNF－α 和IL－1β、上調IL－4 和IL－10 水平，顯著抑制抗Ⅱ型膠原抗體水平［23］。綜上可知，金藤清痹顆粒可能通過多組分、多途徑發揮治療RA的作用。

本研究對金藤清痹顆粒治療RA 進行了初步的藥效學考察，結果顯示給藥4 周后，與Model 組相比，JTQB－H 組可顯著降低大鼠血清TNF－α、IL－1β 水平（P< 0.05），JTQB－L 組可顯著降低大鼠血清IL－1β 水平（P< 0.05），且呈一定的量效關系，此外JTQB－H、JTQB－L 組均能有效降低CIA 大鼠踝關節腫脹及減少滑膜細胞增生和炎性細胞浸潤，說明RA具有較好的治療RA 作用。唐今揚等［24］研究發現，金藤清痹顆粒可減輕RA 大鼠關節腫脹，顯著降低外周血中IL－1β、IL－17水平（P< 0.05），與本研究結果一致。金藤清痹顆粒可通過調控TLR4/NF－κB 信號通路來改善免疫微環境，從而緩解RA相關癥狀［25］。

為進一步深入探討金藤清痹顆粒治療RA 的作用機制，本研究采用代謝組學觀察JTQB－H 對RA 大鼠體內代謝物的影響。結果顯示，JTQB－H 可上調11－酮－β－乳香酸，下調DL－絲氨酸、苯乙酸、苯乙酰甘氨酸等在內的12 個顯著差異代謝物。有研究發現，11－酮－β－乳香酸的納米顆粒配方不僅可增加其1.7 倍抗炎活性，更能提高其7 倍的口服利用度［26］。ZHANG 等［27］在探討中藥復方黃連解毒湯及其成分對RA 大鼠作用機制時，發現其可使RA 模型組大鼠苯乙酰甘氨酸水平恢復正常。苯乙酸致炎狀態可能與其增加多形核白細胞各種功能的激活和表面CD11b 和CD18 的表達有關［28］。以上報道結合本次篩選的差異代謝產物結果，提示金藤清痹顆粒發揮治療RA 藥效可能是通過調控多個代謝物共同發揮作用。

對上述差異代謝物進行通路分析，發現金藤清痹顆粒主要通過調控甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、亞油酸代謝、苯丙氨酸代謝、氨酰tRNA 生物合成等通路來發揮療效。石愛華等［29］利用代謝組學探討清熱養陰湯治療RA 的作用機制，發現其調控通路涉及氨酰tRNA 生物合成、絲氨酸和蘇氨酸代謝、亞油酸代謝等通路。趙傳怡［30］在探討牛白藤中龍膽苦苷治療RA及其代謝組學研究，發現其調控的通路主要與苯丙氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，氨酰生物合成等代謝通路相關。可見，甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、亞油酸代謝、苯丙氨酸代謝、氨酰tRNA 生物合成與RA 密切相關，金藤清痹顆粒可通過調控上述氨基酸代謝通路發揮治療RA療效。