急性冠脈綜合征氣虛血瘀患者LC－MS血清代謝組學分析

陳婷，任廣勝，李姍珊?，徐燕

（1. 上海市嘉定區中醫醫院，上海 201899； 2. 上海市嘉定區中心醫院，上海 201899；3. 上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203）

2019 年調查顯示，每5例死亡病例中就有2例死于心血管病（cardiovascular disease，CVD），推算冠心病患者1 139萬，且CVD給國家及個人造成嚴重的醫療負擔，缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）的次均住院費用為14 060.20元，其中心絞痛15 486.51元、急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）30 368.54元［1］。急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是冠心病中的急危重癥，發病后病死率高（一年后病死率約15%，五年后病死率約20%［2］），包括ST段抬高型心肌梗死（ST elevated myocardial infarction，STEMI）、非ST 抬高型心肌梗死（non ST elevated myocardial infarction，NSTEMI）以及不穩定型心絞痛（unstable angina pectoris，UAP）。ACS屬“胸痹心痛”“真心痛”“卒心痛”范疇，常見本虛標實或者虛實夾雜，本虛常見“氣虛、陽虛、陰虛、血虛”，標實常見“血瘀、寒凝、氣滯、痰凝”，其中氣虛血瘀證是“胸痹心痛”病中的常見證型。代謝組學通過檢測代謝物水平的整體和動態變化，提取相關的生物代謝標志物群體或標志物簇［3］，有助于發現不同證型的特殊生物標記物，加強對疾病發展過程中物質代謝的了解［4］，促進疾病證型診斷的客觀化［5］，更幫助了解“證”的內涵與實質。因此，本研究采用LC-MS非靶向法分析急性冠脈綜合征氣虛血瘀患者與健康人的代謝產物，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020年9月—2022年6月在上海市嘉定區中醫醫院門診或急診確診為ACS同時辨證符合氣虛血瘀證型的40例患者作為觀察組，其中男性31例、女性9例，年齡（64.75 ± 11.77）歲，體重指數（26.3 ± 2.51） kg/m2，吸煙27例，合并高血壓34例［病程（7.32 ± 3.03）年，平均收縮壓（139.09 ± 14.23） mm Hg，平均舒張壓（80.18 ± 18.75） mm Hg］，合并血脂異常者28例，合并糖尿病16 例，合并慢性腎臟病8 例。本研究同時納入同期在我院體檢的健康人群為對照組，其中男性23 例、女性17 例，年齡（51.88 ± 6.97）歲，體重指數（25.38 ± 1.88） kg/m2，吸煙16例。本研究已通過上海市嘉定區中醫醫院倫理委員會批準，批準號：JZY201906。

1.2 診斷標準

ACS 西醫診斷標準參照非ST 段抬高型急性冠狀動脈綜合征基層診療指南（2019 年）［6］及急性ST 段抬高型心肌梗死診斷和治療指南（2019）［7］。中醫診斷標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》［8］中氣虛血瘀證辨證標準，胸悶胸痛，心悸氣短，神倦乏力，面色紫暗，舌淡紫，脈弱而澀。健康人群中醫診斷參照《中醫體質分類與判定》［9］中平和質的判定標準。

1.3 排除標準

主動脈夾層、肺栓塞等非冠脈堵塞引起的胸痛；嚴重心力衰竭；嚴重肺功能不全；肝功能衰竭；腎功能衰竭；惡性腫瘤；精神疾病患者；受孕或哺乳期女性，意識障礙等。

1.4 標本采集和制備

觀察組取治療前在室溫下釆取靜脈血4 mL，對照組取清晨空腹靜脈血4 mL，3 000 r/min 離心10 min后收集血清置1.5 mL Eppendorf 管中，轉至-80 ℃冰箱中保存備用。

1.5 代謝物檢測和分析

代謝組學的檢測和分析由上海百趣生物科技有限公司完成，包括樣品的處理、LC－MS 非靶向血清代謝組檢測和數據處理分析。

1.5.1 主要實驗儀器與試劑

超高效液相（Thermo Fisher Scientific，型號：Vanquish）；質譜儀（Thermo Fisher Scientific，型號：Orbitrap Exploris 120）；離心機（Thermo Fisher Scientific，型號：Heraeus Fresco17）；天平（Sartorius，型號：BSA124S－CW）；超聲儀（深圳市雷德邦電子有限公司，型號：PS－60AL）。

甲 醇（CNW Technologies） ；乙 腈（CNW Technologies）；乙酸銨（SIGMA－ALDRICH）；氨水（Fisher Chemical）；超純水（屈臣氏）。

1.5.2 樣品處理及檢測

移取50 μL 樣品至EP 管中，加入200 μL 提取液，甲醇∶乙腈=1∶1（V/V），含同位素標記內標混合物（正離子模式含氧化三甲胺－d、9 N－氧化物、4－氨基丁酸－2，2，3，3，4，4－d6、L－亮氨酸－5，5，5－d3；負離子模式含琥珀酸－2，2，3，3－d4、L－亮氨酸－5，5，5－d3、馬尿酸－d5），渦旋混勻30 s，超聲冰水浴10 min，-40 ℃靜置1 h； 將樣品4 ℃，12 000 r/min［離心力13 800 ×g，半徑8.6 cm］離心15 min；取上清于進樣瓶中上機檢測。使用Vanquish 超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm））液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離 。液相色譜A 相為水相，含25 mmol/L 乙酸銨和25 mmol/L 氨水，B 相為乙腈。樣品盤溫度：4 ℃，進樣體積：2 μL。Orbitrap Exploris 120 質譜儀能夠在控制軟件控制下進行一級、二級質譜數據采集。

1.6 數據處理

使用ProteoWizard 軟件將原始數據轉成mzXM 格式后，經自主編寫的R程序包（內核為XCMS）進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理 ，然后與BiotreeDB（V2.1）自建二級質譜數據庫匹配進行物質注釋，算法打分的Cutoff 值設為0.3。數據釆用平均中心化或 Pareto 標度化進行預處理之后釆用PCA分析。為強化組間差異，進一步采用偏最小二乘法－判別分析（PLS－DA）分析。基礎數據分析包括數據預處理，PCA 分析，PLS－DA 分析，正交偏最小二乘法－判別分析（OPLS－DA），差異化合物篩選和鑒定。高級數據分析包括代謝通路分析。

2 結果

2.1 質量控制

所有樣品另取等量上清混合成質量控制（quality control，QC）樣品，QC 樣品相關性越接近于1（至少應 >0.8），說明整個方法穩定性越好以及數據質量越高。正負離子QC 樣品相關性分析見圖1、圖2，可以看出QC樣品相關性很高，說明本次實驗方法穩定性高以及數據質量也很高。

圖2 負離子QC樣品相關性分析

2.2 兩組正交偏最小二乘法－判別分析（OPLS－DA）比較

觀察組對對照組的OPLS－DA 模型由置換檢驗的點狀圖見圖3、圖4。正離子模式（positive ion mode，POS）下兩組間模型對Y 變量數據集的可解釋度（R2Y值）為 0.973、模型可預測度（Q2值）為 0.93，負離子模式（negative ion mode，NEG）下兩組間R2Y 值分別為0.961、Q2值分別為 0.914，說明觀察組與對照組兩者有良好的區分特性，兩者之間存在顯著的差異。

圖3 觀察組對對照組OPLS－DA模型的置換檢驗結果柱狀圖（POS）

圖4 觀察組對對照組OPLS－DA模型的置換檢驗結果柱狀圖（NEG）

2.3 觀察組與對照組的差異代謝物比較

本研究使用的卡值標準基于以下指標：t檢驗的P值 < 0.05，OPLS－DA模型第一主成分的變量投影重要度（VIP） > 1，以及二級匹配的打分（MS2 score）取值［0，1］，數值越大越好。Q值是假設檢驗統計量（P值）經多重假設檢驗校正之后的結果，是對P值的再統計。由此篩選出32 個符合條件的差異代謝物，POS 模式下分別為蕨內酰胺、煙酰胺、次黃嘌呤、乙酰肼、7－甲基鳥嘌呤、苯丙氨酸、三丙酸甘油酯等，NEG 模式下分別為左旋纈氨酸、左旋正亮氨酸、谷氨酸、乙醇酸、花生四烯酸、α－D－葡萄糖、肌酐等。見表1。

表1 差異代謝物質信息匯總

2.4 觀察組與對照組的代謝通路比較

本研究共得出58 條可能受差異代謝物擾動的代謝通路，其中8 條通路P值 < 0.05，11 條通路Impact ≥0.1，說明這些通路受差異代謝物擾動較大，可作為ACS 氣虛血瘀患者病理機制的潛在通路，其中4 條代謝通路（精氨酸和脯氨酸代謝，嘧啶代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，谷胱甘肽代謝）同時滿足P< 0.05及Impact ≥ 0.1，可能是與代謝物差異相關性最高的關鍵通路。見表2。

表2 差異代謝物代謝通路匯總表

2.5 差異代謝物的調控網絡分析

在取得每組對比差異代謝物的匹配信息后，分別對對應物種human（hsa）的KEGG數據庫進行通路搜索和調控互作網絡分析。調控分析的結果以網絡圖展示，結果見圖5。

圖5 調控網絡分析圖

3 討論

冠心病是一種與炎癥和氧化應激相關的復雜人類疾病，代謝組學有助于闡明冠心病發生和發展的潛在機制［10］。ACS屬“胸痹心痛”范疇，《金匱要略》描述“胸痹之病，喘息咳唾，胸背痛，短氣，寸口脈沉而遲”，指出其病機為“陽微陰弦”，認為胸痹是由于胸陽不振，氣虛血停瘀滯不通，陰邪下盛，導致氣機不暢，不通則痛。所以胸痹病虛實夾雜，而氣虛血瘀則是其重要的證型。自古以來，中醫藥一直是治療胸痹心痛的有效且重要的手段，但是無法客觀化、標準化一直是困擾中醫藥發展的難題。利用代謝組學檢測提取相關的生物代謝標志物簇，有助于發現不同證型的差異代謝物及代謝通路、調控網絡，進一步了解疾病發展過程中的物質代謝，幫助了解疾病及證型的本質，為中醫藥防治疾病提供理論依據。

本研究發現，ACS 氣虛血瘀患者與健康人的顯著差異代謝物32 種，蕨內酰胺、煙酰胺、次黃嘌呤、乙酰肼、7－甲基鳥嘌呤、苯丙氨酸、三丙酸甘油酯、L－纈氨酸、L－正亮氨酸、谷氨酸、乙醇酸、花生四烯酸、α－D－葡萄糖、肌酐、黃嘌呤、十二酸、假尿嘧啶核苷、左旋別蘇氨酸、甘油酸、D 木糖及D－絲氨酸等代謝物可作為鑒別二者的潛在生物標志物。動脈粥樣硬化伴IHD 涉及兩個方面：第一是氧化應激，過量產生降低谷胱甘肽（GSH）水平的活性氧（ROS），第二就是炎癥［11］。蕨內酰胺是一種生物活性較強的谷胱甘肽酶，谷氨酸是谷胱甘肽的組成成分，兩者是體內谷胱甘肽代謝的重要催化物及底物。谷胱甘肽是體內能維持足夠的氧化還原細胞信號以控制生命過程所必需的氧化應激的生理水平，還能限制導致細胞和組織損傷的過度氧化應激，對生命至關重要［11］。煙酰胺主要用作維生素B3的營養補充，而維生素B3可以被用于合成輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）以助細胞能量代謝和防御，煙酰胺還可恢復細胞NAD 池和線粒體能量，減輕氧化應激和炎癥反應［12］。次黃嘌呤（HX）是黃嘌呤的前體，是嘌呤代謝的重要原料，HX 在黃嘌呤氧化酶（X0D）催化下形成尿酸，而尿酸升高是冠心病的重要危險因素［13］。甲基鳥嘌呤是一種抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP－1）的天然化合物，PARP－1 被公認為與DNA修復有關，所以甲基鳥嘌呤可能阻止遺傳毒性DNA 的復制［14］。假尿嘧啶核苷目前常用于基因調控，在癌癥RNA 編輯修飾中應用廣泛，常用于闡述基因表達、功能和潛在的分子機制［15］。苯丙氨酸、左旋纈氨酸、左旋正亮氨酸、左旋別蘇氨酸、D－絲氨酸等主要被用來合成人體蛋白質，以達到機體蛋白質的不斷更新和修復。花生四烯酸在細胞內主要通過環氧合酶（COX）途徑、脂氧合酶（LOX）途徑、細胞色素P450 單氧化酶（CYP450）途徑等進行代謝［16］，可以產生大量的活性物質，具有促炎和促血小板聚集作用，可能增加冠心病的風險［17］。D－木糖與葡萄糖的化學性質相似，參與磷酸戊糖代謝途徑（pentosephosphate pathway，PPP）。研究發現，脾胃氣虛、脾失健運會導致代謝失調，出現消化動力不足、腸道吸收功能障礙，出現為血清D－木糖降低及尿D－木糖排出水平下降［18－20］。D－絲氨酸參與大腦發育、神經元興奮、突觸可塑性以及學習和記憶的調節［21］，D－絲氨酸生成、氧化代謝途徑與糖尿病、癲癇、阿爾茨海默病等的發生、發展有密切關系［22］。

本研究共得出4 條（精氨酸和脯氨酸代謝，嘧啶代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，谷胱甘肽代謝）代謝通路可能是ACS 氣虛血瘀患者代謝物差異相關性最高的關鍵通路。MARTIN 等［23］發現，精氨酸－脯氨酸代謝可以被確定為監測動脈粥樣硬化、ACS 和恢復的新靶點，不管是基于動物模型還是人類的代謝研究中，在ACS 中共同的代謝途徑是精氨酸和脯氨酸代謝以及谷胱甘肽代謝。DURANTE［24］發現，在動脈粥樣硬化和動脈損傷中，精氨酸酶活性增加，鳥氨酸合成多胺，組織中多胺水平升高，激活的多胺抑制血小板聚集，與ACS 事件密切相關。既往研究發現，在冠心病患者中心肌嘌呤和嘧啶核苷酸含量存在一定的紊亂，推測這些紊亂在肌肉功能障礙的發病機制中起一定作用［25］，但由于證據比較久遠，還需進一步試驗論證。甘氨酸和絲氨酸以及蘇氨酸代謝常被用于抗生素及耐藥性等相關試驗，未見與冠心病相關報道，可能與ACS 發生后炎癥因子的清除有關。此外，ACS 氣虛血瘀患者代謝物差異相關性較高的通路為牛磺酸和亞牛磺酸代謝，咖啡因代謝，氨酰tRNA 合成酶，氮代謝，二羧酸代謝，磷酸戊糖途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，D－谷氨酰胺和D－谷氨酸代謝，組氨酸代謝，苯丙氨酸代謝和亞油酸代謝，其中牛磺酸和亞牛磺酸代謝、氨酰tRNA 合成酶、氮代謝、組氨酸代謝、苯丙氨酸代謝是體內的氨基酸代謝的重要途徑；二羧酸代謝、亞油酸代謝與體內脂肪代謝有關；PPP 是體內重要的糖代謝途徑，除了提供能量，PPP 向細胞提供核糖－5－磷酸（R5P）和NADPH，后者在消除細胞內的活性氧、還原生物合成中起關鍵作用［26］。

本研究證明ACS 氣虛血瘀患者血清代謝譜發生了特異性變化，除了氧化應激和炎癥反應，能量代謝、脂肪代謝、氨基酸代謝均發生了紊亂，可以為ACS 氣虛血瘀證型提供一定的證據，但樣本量少，未進行ACS患者的進一步分型，仍需進一步實驗論證。