多重PCR技術在植物病原物檢測中的應用

曹子健， 邱艷紅， 王爽， 趙娟， 鄭素月， 喬廣行， 秦文韜*

（1.北京市農林科學院植物保護研究所，北京 100097； 2.河北工程大學園林與生態工程學院，河北 邯鄲 056038； 3.北京市農林科學院蔬菜研究所，北京 100097； 4.北京市頤和園管理處，北京 100097）

受氣候環境、種植模式、經濟全球化等因素的影響，重大植物病害頻發，引發了一系列嚴重的生態環境及農業安全問題，成為全球農業面臨的重要挑戰[1-2]。病原物能侵染不同生長階段的植物引起嚴重的植物病害，危害農業安全。對病原物進行檢測和診斷有助于掌握植物病害的流行病學、地理分布等重要信息，從而對植物病害綜合管理和控制策略提供依據，有效避免植物病原物的引入和傳播[3]，因此，建立高效準確的病原早期預警和快速診斷體系是防控植物病害的關鍵[4]。

早期植物病原的診斷依賴于癥狀識別和簡單的分離培養技術。傳統檢驗技術遠不能滿足當前農業精準化發展需求。隨著技術的發展逐漸出現了蛋白水平鑒定、核酸分子檢測、光譜分析檢測及多技術聯合檢測等方法。其中，以聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術為基礎衍生出的一系列核酸分子檢測方法憑借檢測速度快、準確率高、靈敏度高等優點得以快速發展并廣為利用。1988 年，Chamberlain 等[5]首次報道了多重PCR（multiplex PCR，mPCR）技術，并將其用于同步擴增多個序列以檢測基因的缺失情況。由于具有高效、操作簡便、成本低廉以及系統性的明顯優勢，該技術在近幾十年來得以迅速發展，在植物病原檢測上的應用尤為突出。因此本文系統綜述了多重PCR 技術在植物病原真菌、細菌、病毒、線蟲檢測中的應用現狀，并分析了該技術目前存在的問題，展望了該技術未來的發展前景，以期為植物病原物的早期診斷和植物病害的科學防控提供技術支撐，同時也為該技術更好地應用提供借鑒。

1 多重PCR技術的原理

多重PCR 技術在傳統PCR 技術的基礎上發展而來，可在單一反應體系中針對多個位點擴增以實現多種靶標病原的檢測（圖1），具有通量高、成本低的優點[6]。由于多重PCR 是在同一反應中利用多對引物進行靶標擴增，隨著引物的增加，引物間的相互作用會降低檢測靈敏度，增加檢出難度[7]，因此在構建多重PCR 體系時，要求引物之間的退火溫度盡可能相近，引物對的擴增產物能夠區分，且在反應過程中引物間不能交叉。經過多年發展，多重PCR 衍生出多種類型，根據靶標類型可分為巢式PCR（nested PCR，nPCR）、系統型特異多重PCR（phylotype-specific multiplex PCR，Pmx-PCR）、多重串聯PCR（multiplexed tandem PCR，MT-PCR）等；依據PCR種類又包括實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、反轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）、數字PCR（digital PCR，dPCR）等；依據PCR 反應平臺分為微流控的PCR、固相載體的PCR 等[8-9]。目前，多重PCR 不僅能進行基因分型以及多病原快速檢測，還可以用來研究某些微生物群落的結構，并評估微生物的群落動態或對環境變化的響應[10]。

圖1 多重PCR原理Fig. 1 Principle of multiplex PCR

2 多重PCR 技術在植物病原物檢測中的應用

2.1 植物病原真菌檢測

真菌是第一大植物病原，植物病原真菌快速檢測是植物病害綜合防控的重要基礎[11]。植物病原真菌的傳統診斷方法需要對病原培養，然后進行顯微鏡觀察及致病性試驗，該方法周期較長，且要求檢驗人員具備一定的專業知識；此外，不同病原真菌形態特征較相似，在同一寄主上可能導致相似的癥狀，因此，病原真菌的精準診斷是制定科學防控策略的前提和關鍵。利用高特異性的DNA 檢測技術可有效提高植物病原真菌鑒定的速度和準確性[12]。目前，多重PCR 技術已經廣泛應用于常見的植物病原真菌檢測過程中，并為植物真菌病害的防控提供了技術支撐。

炭疽菌（Colletotrichum）是引起禾本科植物、果樹、花卉、蔬菜等多種植物炭疽病的全球性植物病原真菌[13]。楊怡華等[14]通過巢式雙重PCR 技術檢測麥冬炭疽病病原菌山麥冬炭疽菌（C. liriopes）和黑斑病病原菌互隔交鏈孢菌（Alternaria alternata），靈敏度高達100 pg?μL-1DNA。Wang等[15]應用高分辨率熔解（high-resolution melting，HRM）技術對Colletotrichum spp.、疫霉菌（Phytophthora spp.）和菜豆殼球孢（Macrophomina phaseolina）的多重PCR反應產生的特異性融化峰進行分析，提高了草莓冠腐病病原體檢測和分化的準確性。

立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的植物根腐病是常見的土傳病害，可為害多種蔬菜的幼苗、根、葉和莖。Wallon 等[16]建立了基于ITS（internally transcribed spacer）序列的R. solani及其融合群AG1-IB 的雙重qPCR 體系，靶標的檢測限達到1 μg菌核·g-1干燥土壤。

鐮刀菌屬（Fusarium spp.）在自然界分布極廣，普遍存在于土壤及動植物有機體，能引起小麥、水稻和蔬菜等植物的根腐、莖腐、花腐和穗腐等多種病害[17]。劉芮池等[18]建立了土傳病原菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）的三重PCR（triplex PCR）檢測體系，檢測靈敏度分別為每克土壤105個孢子、106個孢子及10-2mg菌絲。Villarino 等[19]建立的雙重PCR 體系每克土壤中可最低檢測出107孢子和105孢子的腐皮鐮刀菌（F. Solani）和F. oxysporum。

疫霉屬（Phytophthora spp.）真菌是馬鈴薯和番茄晚疫病的病原，常引發毀滅性災害[20]。Liao等[21]通過優化引物、模板濃度以及擴增程序，建立能同時檢測疫霉屬以及樹莓疫霉根腐病菌（P.rubi）、草莓疫霉紅心病菌（P. fragariae）、栗黑水疫霉（P. cambivora）的四重PCR 反應體系，與常規PCR 技術相比，四重PCR 技術對靶標病原的檢測靈敏度雖有所降低，但特異性和通量均有提升。同時，多重PCR 技術也被用來檢測仙人掌上的病原煙疫霉（P. nicotinae）和惡疫霉（P. cactorum）[22]。

腐霉屬（Pythium spp.）屬于卵孢菌綱，許多腐霉屬物種對植物具有致病性，在苗圃、農田等不同生產系統中引起諸多植物病害，如濕腐、根腐、軟腐和莖腐等[23-25]。Ishiguro 等[26]開發了用以鑒定瓜果腐霉菌（Py. aphanidermatum）、旋柄腐霉（Py.helicoides）和群結腐霉（Py. myriotylum）的多重PCR技術。

此外，大斑突臍蠕孢（Exserohilum turcicum）和玉蜀黍平臍蠕孢（Bipolaris maydis）引起的大斑病和小斑病是影響玉米健康生長的2 種重要病害。代玉立等[27]基于交配型基因建立的多重PCR檢測體系能夠很好地區分上述2 種病原及其相應的近緣種，靈敏度可達0.1 ng?μL-1DNA。

2.2 植物病原細菌檢測

細菌作為植物病害的第二大病原，可在種子、病殘體、土壤、糞肥、雜草寄主或昆蟲體內越冬或越夏，侵染植物后可出現腐爛、壞死、萎蔫、變色、畸形等癥狀。有些植物細菌病害和生理性病害癥狀相似，一些病原難以人工培養，采用多重PCR技術可有效提高植物病原細菌的檢測效率。

黃單胞菌屬（Xanthomonas spp.）細菌能導致多種植物產生非特異性的癥狀，形態上難以區分，因此相關學者開發了許多快速、靈敏和特異的診斷方法[28]。Strayer 等[29]研究發現，4 種黃單胞菌的hrpB7 基因存在單核苷酸序列多態性，基于此設計了4組特異性探針和2對引物，開發的多重實時熒光PCR 能夠檢測105~108CFU?mL-1的細菌DNA。在柑橘潰瘍病檢測方面，建立了針對X.citri pv. citri、X. citri pv. aurantifolii B 型和C 型3 種柑橘潰瘍病菌的多重PCR 檢測方法[30-31]。Jouen等[32]基于2 套引物和探針建立的雙重qPCR 方法可檢測Xanthomonas spp.，其中一套引物源于紅掌細菌性枯萎病病原X. phaseoli pv. dieffenbachiae 的ABC 轉運蛋白基因；另一套源于紅掌的查爾酮合酶基因作為內參。Webber 等[33]基于膜蛋白基因（filamentation temperature sensitive X，ftsX）和奎尼酸代謝基因（quinate metabolicgene，qumA）設計引物，建立了X. arboricolapv.corylina的雙重PCR 檢測方法。

棒形桿菌屬（Clavibacterspp.）能侵染多種植物，引起細菌性潰爛、葉片萎蔫，形成水皰樣斑點，最終導致整株壞死。Thapa 等[34]基于番茄細菌潰瘍病病原菌（C. michiganensis）的染色體基因rhuM和tomA設計引物，并以植物16S rDNA 基因作為內參建立了多重PCR 的診斷平臺，檢測限為0.01 ng DNA。

茄科雷爾氏菌群（Ralstonia solanacearumspecies complex，RSSC）引起的植物青枯病是一種破壞性極強的細菌性病害，RSSC 包含1 個高度異質性的細菌群，且種群的寄主范圍十分廣泛。He等[35]利用Pmx-PCR結合基于巨胞質內切葡聚糖酶基因（egl）的系統發育樹，對不同植物RSSC 菌株進行系統分型。Sharma等[36]同樣通過多重PCR檢測對盧旺達馬鈴薯青枯病RSSC 進行系統分型，并依此繪制流行病學推斷分布圖。研究青枯病RSSC 群體分布和系統發育變異可為制定植物青枯病的防治策略提供依據[37]。李得銘等[38]利用3 對特異性引物構建了番茄青枯病菌（R.solanacea）的三重PCR體系，可以精準的從植株與土壤中定性監測到該病原菌，單一PCR 檢測靈敏度為5 ng?μL-1DNA，而三重PCR 方法對青枯菌的模版DNA 檢測濃度最低為10-3ng?μL-1，大大提高了土壤中青枯病病原菌的監測監控能力，并能有針對性地預防和控制番茄病害，為番茄產業的可持續發展提供了強有力的技術支撐。

谷枯病、白葉枯病、細菌性褐條病是水稻生產中的3 種主要細菌性病害，病原菌分別為莢殼伯克霍爾德氏菌（Burkholderia glumae）、稻黃單胞菌水稻致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）和燕麥嗜酸菌燕麥亞種（Acidovorax avenaesubsp.avenae）。Kang 等[39]根據16S 和23S rDNA 序列及轉座酶A 基因序列構建了這3 種細菌的檢測體系，檢測限分別為10-2~10-4的稀釋液。

2.3 植物病毒檢測

病毒作為植物病害的第三大病原，種類繁多、變異快，且大多具有潛伏侵染的特點，常導致毀滅性的病害，對植物的生長發育造成了嚴重威脅[40]，因而應用分子技術檢測植物病毒十分必要[41-42]。由于植物病毒大多數為RNA 病毒，多用RT-PCR技術進行檢測，并且仍可利用多重PCR 技術提高檢測效率。

在糧食作物病害研究領域，大豆是全球重要的油料作物，而病毒病嚴重影響大豆的產量和品質。大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus，SMV）、豆類普通花葉病毒（Bean common mosaic virus，BCMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是大豆生長過程中為害最嚴重的3種病毒，Xue 等[43]基于病毒的外殼蛋白基因構建了上述3 種病毒的三重PCR 檢測體系，檢測限為7×10-1ng?μL-1RNA。花生矮化病毒（Peanut stunt virus，PSV）和番茄環斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）是我國進境植物檢疫性有害生物，可通過染病大豆進行傳播，袁俊杰等[44]利用雙啟動寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）建立了能同時檢測上述2 種病毒的雙重RT-PCR 檢測體系，該體系具有對45~65 ℃退火溫度不敏感的優點。 Maina 等[45]基于高通量測序（highthroughput sequencing，HTS）技術開發了靶向基因組測序（targeted genome sequencing，TG-Seq），并將其應用于谷類作物上常見的CMV、豌豆早褐病毒（Pea early browning virus，PEBV）、菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV）和豌豆種傳花葉病毒（Pea seedborne mosaic virus，PSbMV）4 種病毒的檢測，TG-Seq 能檢測出凝膠電泳檢測不到的BYMV 和CMV 的擴增子，表明TG-Seq 具有更高靈敏度。針對玉米病毒病，李明駿等[46]建立了5 種玉米病毒的多重PCR 檢測體系，可同時檢測出甘蔗花葉病毒（Sugar-cane mosaic virus，SCMV）、玉米褪綠斑駁病毒（Maize chlorotic mottle virus，MCMV）、水稻黑條矮縮病毒（Rice black streaked dwarf virus，RBSDV）、玉米黃化花葉病毒（Maize yellow mosaic virus，MaYMV）和留尼旺玉米線條病毒（Maize streak reunion virus，MSRV）。Li等[47]建立了基于延伸因子1α（TEF1-α）基因檢測玉米上常發生的MCMV、SCMV、MaYMV以及相關的整體病毒（Maize-associated totivirus，MATV）的多重RTPCR檢測方法，靈敏度可達100 pg?μL-1DNA。

在果樹病害研究領域，黃愛軍等[48]基于文獻以及CP和p25基因成功建立了柑橘病害多重RTPCR 檢測方法，可同時檢測出柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）、柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV）、柑橘黃化脈明病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）和柑橘葉斑病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV）4 種病毒。Peng等[49]基于CP基因設計引物以分別擴增獼猴桃褪綠環斑相關病毒（Actinidia chlorotic ringspotassociated virus，AcCRaV）、獼猴桃病毒1（Actinidia virus 1，AcV-1）、獼猴桃病毒A（Actinidia virus A，AcVA）和CLBV，并以肌動蛋白基因（ACT1）為內部對照成功構建多重RT-PCR，檢測限為10-4cDNA。

此外，多重PCR 技術還廣泛應用于觀賞花卉和熱帶經濟作物的病毒和類病毒研究領域，目前已報道的可侵染菊花的病毒和類病毒超過20 種，能夠導致菊花減產10%~30%。Zhao 等[50]建立菊花病害的多重RT-PCR 用以同時檢測番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV）、菊花B 病毒（Chrysanthemum virus B，CVB）、CMV、煙草普通花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、馬鈴薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）、菊花矮化類病毒（Chrysanthemum stunt viroid，CSVd）和菊花褪綠斑駁類病毒（Chrysanthemum chlorotic mottle viroid，CChMVd），為大規模調查病毒病害提供一種可行的方法。Muller 等[51]發現在大多數可可的基因組中整合了內源性可可桿狀病毒（endogenous T.cacao bacilliform virus，eTcBV）的序列，對插入病毒序列的兩側設計引物組，陽性結果會擴增出2 條帶，陰性結果只有1 條帶，可以準確檢測eTcBV 的存在，降低經濟損失。

2.4 植物病原線蟲

植物寄生線蟲是常見的土傳植物病原，包括孢囊線蟲（Globoderaspp.）、根結線蟲（Meloidogynespp.）、莖線蟲（Ditylenchusspp.）等，它們的寄主范圍十分廣泛，可引起植物褪綠、發育不良，降低農作物產量和品質，部分種類可誘導寄主植物形成根結狀腫瘤，在世界范圍內普遍存在。此外，線蟲通常能在土壤中長期存活，一旦發生很難根除，嚴重影響下季茬口的安全生產[52-53]。

馬鈴薯孢囊線蟲包括馬鈴薯金線蟲（Globodera rostochiensis）和馬鈴薯白線蟲（G.pallida），是馬鈴薯生產的重要瓶頸，因其嚴重的破壞性被世界各國列入檢疫對象。Nikitin 等[54]基于ITS1 區域建立的微陣列實時PCR 檢測體系可同時檢測G. rostochiensis和G. pallida，檢測限分別達到1 和10 pg?μL-1。針對阿爾及利亞的馬鈴薯孢囊線蟲，Djebroune 等[55]應用前人研究的常規多重PCR 和熒光實時PCR 對其進行檢測，以明確線蟲的地理分布情況。Gamel 等[56]基于微衛星位點設計TaqMan 探針可以同時檢測G. rostochiensis、G. Pallida和Heterodera schachtii。 種植對G. rostochiensis具有抗性的馬鈴薯品種導致近年來各地為害馬鈴薯的其他種類線蟲檢出量增加[57]，因此，多重PCR的應用有助于植物線蟲的綜合檢測。

根結線蟲（Meloidogynespp.）是世界上最具破壞性的植物寄生線蟲之一[58]。Hu等[59]提取根結線蟲不同生活期的蟲癭DNA，基于28S rRNA 和rDNA-IGS2 區域建立了針對象耳豆根結線蟲（M.enterolobii）、南方根結線蟲（M. incognita）和爪哇根結線蟲（M. Javanica）的多重PCR 檢測體系，檢出率隨線蟲發育而增加。Devran 等[60]利用特異性引物建立的多重PCR 方法可成功檢測M. incognita、M. javanica和花生根結線蟲（M. arenaria）。

莖線蟲屬（Ditylenchus）的鱗球莖線蟲（D.dipsaci）、腐爛莖線蟲（D. destructor）和D. gigas是3種寄主廣泛的線蟲。Jeszke等[61]通過對18S rRNA和rDNA-ITS1區域進行比對設計引物，分別成功建立了三重PCR 和qPCR 快速檢測方法，qPCR 的靈敏度可達0.016 ng?rxn-1。

傘滑刃屬（Bursaphelenchus）是一類具有破壞性的嗜木線蟲。Filipiak 等[62]利用2 種通用引物和3 種特異TaqMan 探針建立了多重實時熒光定量PCR方法，可對松材線蟲（B. xylophilus）、擬松材線蟲（B. mucronatus）、偽傘滑刃線蟲（B. fraudulentus）進行有效檢測，檢測限為30 fg DNA?μL-1。

擬毛刺線蟲（Paratrichodorusspp. ）俗稱粗短根線蟲（stubby root nematodes），可為害寄主植物的根系而引起病變，一些種類還可充當植物病毒的傳播介體。Huang等[63]通過對18S rDNA 和ITS1區序列進行比對，設計引物可同時檢測Paratrichodorus allius、較小擬毛刺線蟲（P.minor）、胼胝擬毛刺線蟲（P. porosus）和Trichodorus obtusus共4種線蟲。

此外，多重PCR 技術在植原體等病原物的檢測方面也有應用。植原體可導致寄主植物代謝紊亂，表現黃化、簇生、矮化、小葉等癥狀，引發棗瘋病、杏褪綠等重要病害。此外，植原體可通過取食植物韌皮部的昆蟲宿主在上千種植物宿主間傳播，造成巨大的損害。由于植原體不能在培養基上培養，因此采用分子檢測方法診斷該病害尤為重要[64]。Gholami 等[65]基于16-23S rRNA 基因間隔區建立了侵染馬鈴薯的3 組重要植原體16SrⅠ、16SrⅥ和16SrⅫ的多重巢式PCR。Galvao 等[66]應用多重PCR 技術快速檢測植原體Phytoplasma和Spiroplasma，以助于掌握玉米叢矮病的流行病學。

3 多重PCR技術存在的問題及發展前景

植物病害的發生是病原、寄主、環境相互作用的結果，發病過程中往往還會受到多種生物或非生物因素的影響，因此依賴于癥狀識別、分離培養等的傳統診斷方法費時費力，且準確率低，遠不能滿足現代農業需求。多重PCR可在同一反應體系中對不同靶標進行擴增，大大提高了樣品檢測通量，可應用于未表現出明顯癥狀或侵染初期的植物病原診斷。該技術的使用可擺脫傳統分離培養診斷方法的束縛，開辟了植物病原物診斷的新途徑。

多重PCR 檢測技術目前在敏感性、穩定性、靶標通量等方面仍存在不少問題（表1）。首先，多個引物對、模板等在同一反應中易出現非特異性擴增，引起檢測結果假陽性或假陰性的問題；其次，mPCR 的產物檢測主要依賴凝膠電泳檢測手段，雖然快速便捷且成本較低，但存在明顯局限性，如其擴增片段長度差異受瓊脂糖凝膠電泳分辨率的限制，可能影響檢測靈敏度；此外，使用凝膠電泳來觀察擴增產物的存在或區分特定擴增產物的大小容易產生假定的光學誤差，增加人工成本等[67]；最后，多重PCR技術不能確定所檢測到的病原體是否具有活性和侵染性，無法推斷出有關的微生物細胞完整性信息，影響流行病學判斷及風險評估，從而限制了應用場景[28]。因此，多重PCR檢測技術在未來有待繼續逐步完善。

表1 多重PCR的優缺點及可結合的技術Table 1 Advantages， disadvantages and the combinable technologies of multiplex PCR

多重PCR 技術與一些分子技術的結合在一定程度上彌補了上述不足。如多重PCR 與qPCR或dPCR 技術結合可實現定量檢測。qPCR 往往利用植物DNA 作為內參評估病原的相對量，而dPCR 能直接表征檢測物的絕對量[17,68]；微流控芯片和液滴式數字PCR 技術與多重PCR 的結合可使靶標處于不同空間進而提高檢測準確率；毛細管電泳、limunex xMAP 等檢測手段能實現更有效的檢測，也為多重PCR 技術結果的分析提供了更優越的手段，具有高靈敏、高通量、高分辨的優勢；膜層析、液相芯片等技術可很好地解決電泳條帶檢測通量小的問題[9]。

現代技術的發展也在不斷促進和提升多重PCR技術的應用范圍和水平。新一代高通量測序技術、生物信息學、微生物基因庫快速擴張以及比較基因組學等方法的發展加速了新DNA 分子標記的出現，提高了檢測體系的靈敏度[69]。Li 等[70]利用大量李斯特菌（Listeriaspp.）的基因組序列進行泛基因組分析，確定了L. monocytogenes、L.ivanovii的特異性基因靶點和Listeriaspp.共有的基因靶點，據此設計引物并建立多重PCR 檢測體系，檢測限為103~104CFU?mL-1。此外，在特異性引物設計方面可選擇DNA 雜交、BLAST 比對識別等方法，并且隨著大量測序數據的獲得可針對具有種屬間差異的保守序列進行設計，擴大了引物的設計選擇范圍，提高了篩選效率。因此，針對不同應用場景及應用要求，有選擇性地將多重PCR技術與qPCR、dPCR、熒光等技術相結合，能發揮更好的檢測效果，適應更多的植物病原檢測應用需求，及時防止植物病害集中暴發，為科學防控植物病害奠定基礎。