外源促生菌聯(lián)合有機肥對干旱脅迫下參地土壤性狀及人參抗逆性影響

王艷成， 張紀月， 馮帥奇， 梁雪， 張振， 董微巍， 姬文秀

（延邊大學農學院，吉林 延吉 133002）

人參（Panax ginsengC. A. Meyer）為五加科人參屬多年生草本宿根植物，是名貴中藥材，具有安神補氣、養(yǎng)血復脈、健脾益肺、益智延年等諸多功效[1]。我國的人參種植面積及總產值位居世界之首，其中吉林省長白山地區(qū)的人參產量和品質最高，是世界人參主產區(qū)。目前，我國由于農田參栽培技術尚未形成標準化體系，且人參主栽地區(qū)頻發(fā)春旱，在水資源相對緊缺的狀況下，干旱影響人參緩苗及展葉，嚴重制約了農田栽參產業(yè)的綠色健康發(fā)展。

植物通過產生乙烯前體物質1-氨基環(huán)丙烷 -1- 羧 酸（1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）來抵抗寒冷、干旱、洪水、病原體侵染和重金屬污染等，但ACC 隨蒸騰液流上升到植物地上部分，會加速葉片成熟和衰老，導致光合能力下降，從而降低作物產量[2]。植物生長促進根際細菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）具有降解根際ACC 的作用，使植物退化周期縮短，保持根系健壯，能夠較好地耐受環(huán)境脅迫。有機肥部分替代氮肥能夠優(yōu)化冠層氮素分配，使植物葉片的蒸騰速度顯著降低，當植物處于干旱狀態(tài)時，能夠協(xié)助其減少水分散失以提升抗旱能力。李剛等[3]研究表明，施用生物有機肥種植人參可以促進人參地上部生長，增強葉片光合作用，加強植株抗逆能力。薛振東等[4]對消毒后的土壤進行試驗，通過施加有機肥對農田栽參土壤進行改良，不僅能夠降低人參根部的感病率、提高人參抗逆能力，還能夠改善土壤結構、增強土壤肥力，獲得高質高產的人參。

有益微生物群落具有改善植物健康的應用潛力，植物與微生物互作能夠提升宿主植物的抗逆性，挖掘與植物高生產力相關的潛在有益細菌是農業(yè)生物肥料開發(fā)的前提條件[5]。目前對干旱脅迫下農田人參促生菌促生效應協(xié)同有機肥方面的研究鮮見報道。因此，本研究通過外源接種ACC脫氨酶產生菌，結合施用有機肥處理，用化學和現(xiàn)代分子生物學手段相結合的方法，評價施用菌肥對土壤肥效與土壤酶活力、微生物群落以及人參根系酶活力的影響，探討微生物菌肥提高人參抗逆性的可行性，以改善當?shù)赝寥婪柿l件，提高作物產量和品質，為人參種植中應對春季干旱、開發(fā)農田栽參專用生物菌肥提供依據(jù)，為促進農田栽參產業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

OchrobactrumG119 菌株[6]由延邊大學農學實驗室保存，為人參根際促生功能菌（PGPR）。人參苗（2 年生）由吉林省延邊朝鮮族自治州和龍參場提供。試驗有機肥產品由實驗室腐熟雞糞堆肥發(fā)酵而成，其含水量25.7%、總碳285.4 g·kg-1、總氮19.6 g·kg-1、碳氮比（C/N）16.9、全磷 35.4 g·kg-1、全鉀12.6 g·kg-1。

1.2 試驗儀器

制冰機（SIM-124）購自南京晧海儀器儀表有限公司，恒溫恒濕試驗箱（JATH802000）購自上海井岸儀器有限公司，PCR 儀(T100)購自美國伯樂有限公司，連續(xù)流動分析儀（AA3）購自天津中通科技發(fā)展有限公司，馬弗爐（HYP-308）購自深圳市三莉科技有限公司，火焰光度計（FP640）購自青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司。

1.3 試驗設計

篩選健壯人參苗進行試驗，共設計4 個處理。處理1：未添加有機肥和促生菌的對照組（CK）；處理2：僅施用有機肥（F）；處理3：僅施用促生菌（J）；處理4：有機肥和促生菌混合施用（J+F）。每處理重復3次，每重復3盆，每盆栽植人參苗3株。塑料花盆尺寸25 cm×10 cm，裝入1.65 kg 試驗用土。其中，有機肥施用量均為500 g·盆-1；施用的促生菌為G119，菌含量1.0×10-8cfu·mL-1，用量25 mL。試驗前各處理進行統(tǒng)一灌溉，試驗期間為盆栽人參搭建避雨棚并加蓋1 層遮陰網(wǎng)，以防止降雨對試驗的干擾。當各處理含水量達70%后不再澆水，自然干旱10 d，使各盆栽土壤含水量達到35%~45%時取人參植株及其根際土壤帶回實驗室，用于各項指標的測定。

1.4 測定指標和方法

1.4.1土壤含水量測定 收集土壤樣品，立即稱量鮮重（fresh weight，F(xiàn)W），然后放入105 ℃烘干箱烘干48 h，稱干重（dry weight，DW），并計算土壤含水量（soil water content，SWC）。

1.4.2土壤pH與電導率測定 土壤pH和電導率（electric conductivity，EC）采用5∶1的水土比，分別用雷磁pH計和電導率儀測定。

1.4.3土壤養(yǎng)分含量測定 采用CaCl2浸提土壤后，用培養(yǎng)皿擴散法測定土壤堿解氮含量；采用0.5 mol·L-1NaHCO3法測定土壤速效磷含量；采用火焰光度法和火焰光度計測定土壤速效鉀含量[7]。

1.4.4土壤酶活性測定 采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定土壤脲酶（urease）活性，以24 h 后每克土壤中NH3-N 的毫克數(shù)來表示脲酶活性；采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定土壤蔗糖酶（sucrase）活性，用24 h 后每克土壤葡萄糖的毫克數(shù)表示[8-9]。

1.4.5土壤總DNA 提取、PCR 擴增及高通量測序 采用 PowerSoil?DNA Isolation Kit 試劑盒提取土壤 DNA，通過高通量測序測定16S rRNA 基因的V3~V4 區(qū)，PCR 擴增引物為F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’；R：5’-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3’。PCR 體系20 μL：5×PCR Buffer Ⅱ 4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，0.4 μmol·L-1的正、反向引物各0.8 μL，TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.4 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 補充至20 μL。PCR 程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，25 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產物經(jīng)試劑盒回收后，采用Illumina HiSeq 測序平臺進行高通量測序（北京百邁客生物科技有限公司）。

1.4.6人參抗氧化酶測定 采用氮藍四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）法檢測人參超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用愈創(chuàng)木酚比色法檢測人參過氧化物酶（peroxidase，POD）活性；采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性；采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法測定丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量[9]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

基于 Illumina HiSeq 測序平臺，利用雙末端測序(paired-end)的方法，構建小片文庫進行測序。通過對Reads 拼接過濾，在相似性97%水平上進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，對物種進行注釋及豐度分析。進一步利用Mothur 1.30 軟件分析α 多樣性，包括Chao1指數(shù)和Shannon 指數(shù)。利用QIIME1.8.0 軟件分析β 多樣性，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）土壤細菌群落結構的相似性與差異性。采用Excel 2016 與SPSS 17 進行各處理間土壤理化性質、土壤酶活力以及人參酶活力數(shù)據(jù)整理和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下施加促生菌與有機肥對土壤理化性質的影響

土壤含水率、pH 和EC 的變化對植物的生長有顯著影響，土壤中的堿解氮、有效磷和速效鉀是人參生長所必需的礦質營養(yǎng)元素。從表1 可以看出，不同處理組間的理化性質存在顯著差異（P<0.05），其中J+F 處理的土壤含水率、pH、EC 及堿解氮、有效磷和速效鉀含量均高于其他處理，說明促生菌和有機肥具有協(xié)同作用，有利于提高土壤有效養(yǎng)分含量。F 處理土壤的堿解氮和有效磷含量顯著高于J 處理，而速效鉀含量相反，表明對于提高土壤氮、磷含量，有機肥的作用高于促生菌，而在提高土壤鉀含量上，促生菌的作用優(yōu)于有機肥。

表1 不同處理組土壤的理化性質Table 1 Physicochemical properties of soil of different treatments

2.2 干旱脅迫下施加促生菌與有機肥對土壤酶活性的影響

土壤脲酶活性與土壤的微生物數(shù)量及有機質、全氮和速效磷含量呈正相關，因此常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況；蔗糖酶活性與土壤肥力呈正相關，土壤肥力越高，酶活性越高。從表2可以看出，J+F處理土壤的脲酶和蔗糖酶活性顯著高于其他處理（P<0.05）；且單獨施用有機肥或促生菌都能有效提高土壤脲酶和蔗糖酶活性。對于提高土壤脲酶活性，促生菌的作用優(yōu)于有機肥；而對于提高蔗糖酶活性，有機肥的作用優(yōu)于促生菌。

表2 不同處理組的土壤酶活性Table 2 Soil enzyme activities of different treatments

2.3 干旱脅迫下施加促生菌與有機肥對土壤細菌群落的影響

不同處理人參根際細菌在門水平的群落組成如圖1 所示。各處理均共檢測到7 個主要優(yōu)勢菌門，分別為變形菌門（Proteobacteria），擬桿菌門（Bacteroidetes），酸桿菌門（Acidobacteria），放線菌門（Actinobacteria），厚壁菌門（Firmicutes），疣微菌門（Verrucomicrobia）和芽單胞菌門（Gemmatimonadete）。與CK 相比，變形菌門在3 個處理組的相對豐度顯著降低，芽單胞菌門的相對豐度增高。各處理根際細菌門水平相對豐度差異較大。擬桿菌門和酸桿菌門在F 和J+F 處理的相對豐度有所升高，但在J 處理的相對豐度變化較小。

圖1 不同處理組人參根際細菌門的組成Fig. 1 Composition of ginseng rhizosphere bacteria in different treatment groups at phylum level

在屬水平上，4 個處理組的細菌群落組成如圖2所示，共檢測到鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬 （Pseudomonas）、溶桿菌屬（Lysobacter）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、葉黃素單胞菌（Luteimonas）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、波瓦利桿菌（Povalibacter）和新鞘脂菌屬（Novosphingobium）9個菌屬。

圖2 不同處理組人參根際細菌在屬水平上的群落組成Fig. 2 Composition of ginseng rhizosphere bacteria in different treatments at genus level

與CK 相比，J 處理中鞘脂單胞菌屬、溶桿菌屬和德沃斯氏菌屬的相對豐度增加；F 處理中溶桿菌屬的相對豐度增加，假單胞菌屬的相對豐度減少；J+F 處理中假單胞菌屬的相對豐度減少，鹽單胞菌屬的相對豐度最高。即不同處理根際細菌群落組成在屬水平上存在顯著差異，通過外源施用有機肥或促生菌處理可以改變人參根際細菌群落在屬水平上的組成和豐度，其中，溶桿菌屬是促生菌處理后與對照差異較大的共有菌屬。

2.4 干旱脅迫下施加促生菌與有機肥對人參抗逆性的影響

植物正常代謝過程和在各種環(huán)境脅迫下均能產生活性氧和自由基，活性氧和自由基的積累引起細胞結構和功能的損傷，因此，植物需要啟動一系列抗氧化酶系統(tǒng)以清除這些物質。過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是活性氧清除系統(tǒng)中的重要抗氧化酶。丙二醛（MDA）含量是植物細胞膜質過氧化程度的體現(xiàn)，MDA 含量高，說明植物細胞膜質過氧化程度高，細胞膜受到的傷害嚴重。從表3 可以看出，J+F 處理人參的POD、SOD 和CAT 的酶活性顯著高于其他處理（P<0.05）；除CAT外，促生菌對提高酶活性的作用均優(yōu)于有機肥，且兩者間還具有協(xié)同作用。J+F處理人參的MDA含量顯著低于其他處理；J 處理的MDA 含量又低于F 處理，說明促生菌對于緩解干旱對細胞的傷害起主要作用，且有機肥與促生菌間還具有協(xié)同作用。以上結果表明，在干旱脅迫條件下，單獨施用有機肥或促生菌處理均能提升人參在干旱脅迫下的抗氧化能力，而有機肥和促生菌配合施用效果最優(yōu)。

表3 不同處理組之間抗逆性相關因子的變化Table 3 Changes of stress resistance-related factors among different treatment groups

3 討論

活性氧是氧化傷害的最重要來源，當植物處于不利環(huán)境時，會啟動保護自身的抗氧化酶系統(tǒng)以消除過量的氧自由基。在脅迫環(huán)境下，植物的抗氧化酶活性越高，清除體內活性氧的能力越強，對植物體自身的保護程度越高[10]。有關人參干旱脅迫的研究中，大多從干旱脅迫下人參的栽培技術、不同種人參抗性生理指標的比較以及干旱脅迫程度對人參生理生化指標的影響等方面展開[11-13]。然而，通過PGPR 和有機肥的不同組合探討其對人參抗旱性影響的研究還鮮見報道。研究表明，將產ACC 脫氨酶的促生菌接入可降解乙烯的中間產物 ACC，有利于植物抵御干旱脅迫[14]。本研究表明，將人參接種PGPR，或與有機肥配合施用，其抗氧化酶（SOD、POD 和CAT）活性均較CK 顯著提高，表明PGPR 的施用有利于提高人參的抗旱性。

鄭冬梅[15]研究表明，三七的抗氧化酶活性在一定范圍內隨著硝態(tài)氮含量的增加逐漸上升，這是由于植物吸收大量的硝酸根離子，對根系起到一定的保護作用，使根部抗氧化酶活性較高。李憲利等[16]研究表明，在一定范圍內增加土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量，蘋果根系的SOD 和POD 活性升高。本研究表明，添加有機肥或有機肥協(xié)同促生菌處理土壤的硝態(tài)氮含量明顯較高，且人參SOD、POD活性顯著高于CK，與前人研究結果一致。

作物在吸收硝態(tài)氮過程中，會引起土壤pH特別是根際土壤環(huán)境pH的變化，若能使土壤保持較好的氣體流動和通氣效果，土壤中的硝化細菌可將硝態(tài)氮轉化為銨態(tài)氮，同時釋放某種物質，從而引起土壤pH 下降，這種現(xiàn)象又會影響植物對2 種氮素的吸收利用[17]。本研究表明，施用有機肥或有機肥與促生菌配合施用處理的土壤硝態(tài)氮含量較高，且人參根際土壤環(huán)境 pH較低。張衛(wèi)東等[18]研究表明，施入有機肥后短期內不能被完全吸收，引起鹽分的聚集，導致土壤EC 上升，但隨著肥料被吸收土壤EC 會逐漸下降，這與本研究結果一致。

有機肥的施入使土壤營養(yǎng)元素得到轉化，同時能夠加速土壤環(huán)境中的有機-無機物轉化，這些過程有大量細菌、真菌等微生物參與，尤其在植物根部微生物活動更加活躍[19]。植物殘體作為肥料施入土壤后不僅能夠提高土壤肥沃程度，改善土壤結構，對土壤的生物學特性也有重要影響[20]。此外，將秸稈作為肥料施入土壤2 個月后，對土壤肥沃程度和微生物群落組成影響較大，這是由于植物殘體中含有大量的纖維素等物質，激活了土壤環(huán)境中纖維素降解菌群的繁殖和代謝能力[21]。因此有機肥或有機肥與促生菌配施2 個處理中的營養(yǎng)元素含量顯著高于CK，且施入有機肥后的土壤更適宜促生菌生長，使其發(fā)揮作用，顯著提升根系土壤的銨態(tài)氮、速效磷含量。

田稼等[22]研究發(fā)現(xiàn)，土壤脲酶與蔗糖酶活性呈極顯著正相關，同時在一定范圍內這2 種酶的活性與土壤肥沃程度呈正比。土壤中氮肥的水解需要脲酶，脲酶發(fā)生酶促反應后其產物可為作物提供營養(yǎng)元素。宋日等[23]研究表明，生物有機肥可顯著提高土壤脲酶、蔗糖酶活性。有機肥不僅能夠改善植物根際營養(yǎng)條件，改良土壤結構，增加微生物豐度等，還能顯著提高植物抗逆性[24-25]。因此在干旱條件下單獨施用促生菌雖不能提高土壤脲酶活性，但能夠顯著提升蔗糖酶活性，且配合有機肥混合施用效果更顯著。

綜上所述，產ACC 脫氨酶促生菌G119 與有機肥協(xié)同配合施用能夠提高人參抵御干旱脅迫的能力，表現(xiàn)為人參SOD、POD 和CAT 活性增加，分別可達232.89、25.00 和39.50 U·g-1·min-1。促生菌和有機肥處理參地土壤對根際細菌在門水平和屬水平的群落組成和豐度存在較大影響，能適度降低人參根際土壤pH，同時提高土壤EC；人參根際土壤養(yǎng)分含量以及土壤脲酶、蔗糖酶活性均顯著上升。