三維偽連續式動脈自旋標記成像聯合自動分割技術在海馬硬化型顳葉內側癲癇中的應用

閆夢楠，李健，王一婷，擺玉財，李金芹，陳兵*

0 前言

癲癇是一種由腦部神經元異常放電引起的神經慢性疾病，其中海馬硬化型顳葉內側癲癇（hippocampal sclerotic medial temporal lobe epilepsy, MTLE-HS）是最常見的成人藥物難治性癲癇[1]，以神經元丟失和膠質細胞增生為主要特征[2],目前手術切除是治療的有效方法，可以減少70%～90%患者的發作癥狀[3]。因此，術前準確定位致癇灶及其影響區域對盡可能保留非致癇組織和減少術后神經功能缺損至關重要。

臨床上應用正電子發射斷層成像（positron emission tomography, PET） 和 單 光 子 發 射 計 算機斷層成像（single-photon emission computed tomography, SPECT）作為腦代謝及灌注的金標準，該技術在MTLE-HS致癇灶的血流變化對術前定位及術后結果的預測方面具有很高的敏感性[4]，是目前術前預估致癇灶切除范圍的常用方案。但因其時間和空間分辨率較差，具有侵入性，需要輻射暴露且費用昂貴，未能造福更多患者。近幾年新興的磁共振三維偽連續式動脈自旋標記（three-dimensional pseudo-continuous arterial spin labeling, 3D-pCASL）成像提供了一種無創性定量觀察血流灌注的方法[5]。該技術利用標記成像水平上流動脈血中氫質子作為內源性示蹤劑，通過被標記氫質子和組織進行交換來定量血流灌注，形成腦血流量（cerebral blood flow, CBF）信息圖[6]，具有無創、無須注射對比劑、無輻射等優勢。目前研究表明PET/SPECT 與ASL 在病灶的側化方面有較高的一致性[7-8]，具有潛在的臨床應用價值。既往有利用3D-pCASL 研究MTLE-HS 患者雙側海馬區血流灌注改變[9]，但鮮有人關注亞區的灌注情況。因此本研究利用3D-pCASL 聯合海馬自動分割技術探討MTLE-HS患者在海馬亞區級別的血流灌注變化。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經寧夏醫科大學總醫院倫理審查委員會批準（倫理審批號：KYLL-2021-0295），所有納入研究人員均簽署知情同意書。以2021年1月至2022年12月因疑似癲癇在本院行癲癇一體化掃描的545例患者病例為總樣本，經篩選后納入病理診斷（3 例）和MRI 診斷（37 例）的共40 例單側MTLE-HS 的患者病例。其中左側MTLE-HS 29 例，右側MTLE-HS 11 例；女23 例，男17 例，年齡18～60（34.70±12.34）歲；MTLE-HS 的診斷參考國際抗癲癇聯盟（International League Against Epilepsy,ILAE）2014年診斷標準。招募30例健康志愿者，其中女14 例、男16 例，年齡（32.90±10.33）歲。兩組受試者的年齡和性別差異無統計學意義（年齡：t=0.647，P=0.520；性別：χ2=0.807，P=0.268）。

病例組納入標準：（1）癥狀學及腦電圖符合局灶性顳葉內側癲癇；（2）MRI 檢查單側海馬硬化（hippocampal sclerotic, HS）陽性表現；（3）年齡范圍18～60 歲之間；（4）均在癲癇發作間期行MRI 檢查。排除標準：（1）有神經系統及精神方面疾病或者家族史；（2）有引起癲癇癥狀的其他疾病，如腫瘤、外傷、炎癥、皮層發育不良等；（3）有大腦先天性發育畸形；（4）MRI 圖像質量差、不能進行自動分割或分割不匹配及灌注測量融合不匹配。

對照組納入標準：年齡、性別與病例組相匹配。排除標準：（1）癲癇及其他神經系統疾病的家族史；（2）神經系統疾病，如腦腫瘤、腦外傷、炎癥等；（3）存在MRI 檢查禁忌；（4）MRI 圖像質量差、不能進行自動分割或分割不匹配及灌注測量融合不匹配。

1.2 MRI掃描方案

使用GE SIGNA Architect 3.0 T 磁共振儀，48 通道相控陣頭顱線圈，上述納入研究者均行我院癲癇一體化MRI 掃描方案，主要掃描序列參數如下：（1）軸位3D-pCASL序列，標記后延遲時間為1525 ms，TR 4642 ms，TE 53.5 ms，層厚4 mm，激勵次數3，帶寬62.5 Hz；（2）軸位3D T1WI-MPRAGE 序列，等體素（1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm），FOV 256 mm×256 mm，TR 7.7 ms，TE 3.1 ms，翻轉角8°，激勵次數1，帶寬1.25 Hz；（3）垂直于海馬體部斜冠狀位T2WI，TR 2601 ms，TE 85 ms，層厚2.0 mm，層間距1.0 mm，翻轉角111°，激勵次數4，帶寬50 Hz。

1.3 圖像分析

所有圖像先由兩位副高及以上職稱且具有10年以上神經放射影像工作經驗的神經放射醫師采用單盲法獨立分析，通過斜冠狀位高分辨率T2WI 圖像對海馬形態、信號、內部結構等特征進行視覺評估，MRI-HS診斷標準為：（1）直接征象為海馬總體積減小，T2WI 或T2 液體衰減反轉恢復（T2 fluid attenuated inversion recovery, T2-FLAIR）信號增高；（2）間接表現為海馬內部結構消失，條紋模糊或消失，指狀突起變平，同側側腦室顳角擴大、同側穹窿萎縮、乳頭體萎縮、顳葉萎縮等[10]，重點關注海馬大小及T2 信號。意見不一致時，由另一名高級放射科醫師（主任醫師）重新評估，三者協商取得一致意見。

1.4 圖像后處理

1.4.1 自動分割海馬亞區

本 研 究 使 用 美 國MIT Health Sciences &Technology 和 Massachusetts General Hospital共同開發的FreeSurfer 軟件將海馬亞區進行分割，該方法使用海馬解剖概率圖譜，該圖譜源自39 個體內T1WI MRI（1 mm 各向同性體素）與15 個離體MRI（0.10～0.20 mm 各向同性）的數據集組合，體內使用（Caviness, Filipek & Kennedy, 1989）解剖標準，離體主要基于（Rosene & Van Hoesen, 1987）組織學和形態學的標準手動勾畫海馬亞區，通過一種貝葉斯推理的圖譜構建算法，將體內和體外數據合并成一個單一的海馬結構計算圖譜[11]。由此產生的圖譜可以用于自動分割結構化MRI 圖像中的海馬亞區（https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/HippocampalSubfields）。分割具體步驟如下：先將3D T1WI圖像經MRI cron軟件把DICOM文件格式轉換為.nii/.nii.gz格式，傳入Linux系統中FreeSurfer軟件7.3.2 版進行全腦分割（recon-all），包括頭動校正、非均勻強度標準化處理等31個步驟，上述步驟均使用recon-all 腳本實現自動化處理（http://ftp.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/recon-all）。在recon-all 基礎上，使用segmentHA_T1.sh 對海馬亞區分割，將雙側海馬分割為以下亞區：CA1、CA2-3、CA4、齒狀回顆粒細胞層（granular cell layer of dentate gyrus, GC-DG）等[12]。由于CA2、CA3 在MRI上信號缺乏對比度且CA2體積小，故該軟件將其合并未做區分。

1.4.2 海馬亞區CBF值測量

首先經GE 4.7 工作站上應用READY VIEW 軟件將CBF 圖導出，經上述操作轉換格式后傳入Linux 系統，使用FreeSurfer 軟件中freeview 界面打開，配準至受試者3D-T1WI 圖像上，后將FreeSurfer 分割的海馬亞區感興趣區（region of interest, ROI）映射到CBF 圖上[13-14]，得出海馬亞區的CBF 值。為了保證測量海馬亞區時所有被試者的ROI位置相對一致，本研究采用如下測量方案：根據FreeSurfer 分割出HBT 模板即頭、體、尾模板，選取海馬頭、體部中線作為亞區測量的基線，海馬尾部被定義為海馬的最后部，其中無法區分各亞區且體積較小，故在亞區統計時應排除在外[15]。利用FS60 模板即亞區模板，在海馬頭、體部基線及基線前后各2個層面內找尋能完整顯示海馬亞區且亞區體積占比較多的層面作為亞區（CA1、CA2-3、CA4、GC-DG）測量的層面（圖1），求取頭、體兩部分海馬亞區CBF平均值，以兩次測量的平均值作為亞區CBF值最終結果。

圖1 海馬亞區CBF 值測量方法。FreeSurfer 分割：最上方兩幅圖為HBT 模板即頭、體、尾模板，HP_head（紅色）：海馬頭；HP_body（綠色）：海馬體；HP_tai（淡紫色）：海馬尾。下方四幅圖為FS60 模板即亞區模板，分為CA1（紅色）、CA2-3（深綠色）、CA4（土黃色）、GC-DG（藍色）。左側三幅圖以海馬頭部中線為基線顯示測量海馬亞區CBF 值層面，右側三幅圖為海馬體部基線測量海馬亞區CBF 值層面。HBT：FreeSurfer軟件以海馬頭、體、尾作為標準的一種分割模板縮寫；FS60：FreeSurfer軟件以海馬亞區作為標準的一種分割模板縮寫；CBF：腦血流量；GC-DG：齒狀回顆粒細胞層。Fig.1 Measurement method of cerebral blood flow (CBF) value in hippocampal subregion.FreeSurfer segmentation: the top two images are HBT templates (head, body and tail), HP_head (red): hippocampus head;HP_body (green): hippocampus body; HP_tail (mauve): hippocampus tail.And the bottom four images are FS60 templates (subregions).Hippocampal subregion is divided into CA1 (red), CA2-3 (dark green),CA4 (earthy yellow), GC-DG (blue).The three images on the left vertical row take the midline of the hippocampus head as the baseline to show the CBF value of the hippocampus subregion.The three vertical graphs on the right show the level of CBF value of hippocampal subregion measured at the baseline of hippocampus body.HBT: a segmentation template abbreviation for FreeSurfer software using hippocampal head, body, and tail as a standard; FS60: a segmentation template abbreviation for FreeSurfer software using hippocampal subregions as a standard; GC-DG:dentate gyrus granule cell layer.

1.5 統計學分析

使用SPSS26.0 軟件和MedCalc 20.11.5 軟件進行統計學分析。對符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，不符合的以M（Q1，Q3）表示。采用配對t檢驗（正態分布數據）或兩相關樣本Wilcoxon檢驗（非正態分布數據）比較對照組左、右兩側以及MTLE-HS組患側、對側之間海馬亞區CBF值的差異性；采用獨立樣本t檢驗（正態分布數據）或兩樣本Mann-WhitneyU檢驗（非正態分布數據）分別比較對照組與MTLE-HS 患側組，對照組與MTLE-HS 對側組之間海馬亞區CBF 值的差異性；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線及曲線下面積（area under the curve, AUC）評價各亞區CBF 值對MTLE-HS 的診斷效能。P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一致性分析

兩位神經放射醫師診斷HS 的一致性較好（Kappa=0.817，P＜0.05）,海馬亞區CBF 值兩次結果重測信度的一致性良好（組內ICC=0.768，ICC 在0.75～0.90之間為一致性良好）。

近年來，我國農業機械化推廣范圍和推廣力度越來越大，大幅度提升了我國農業生產效率。農業機械化實現了農業生產方式的轉變，帶動了農業產業結構升級，在很大程度上推動了我國農業向著科學化、規模化的方向發展。充分利用機械化技術開展農業生產，應高度重視農業機械化的培訓工作。只有將農業機械化普及到廣大農民群眾中，才能充分發揮農業機械化優勢，從而帶動農業經濟發展[1]。

2.2 對照組左、右側海馬亞區的差異性

健康對照組左、右側海馬亞區CA1、CA2-3、CA4、GC-DG 的CBF 值存在相關性且服從正態分布，使用配對t檢驗發現左、右兩側CBF 值無顯著差異（CA1：t=-0.467，P=0.644；CA2-3：t=1.625，P=0.115；CA4：t=1.273，P=0.213；GC-DG：t=0.966，P=0.342)。因此，本研究將健康對照組的左、右兩側海馬視為一組，得出對照組海馬亞區CA1、CA2-3、CA4、GC-DG 的平均CBF值（表1）。

表1 正常對照組、MTLE-HS組海馬各亞區CBF值差異性比較Tab.1 Comparison of CBF values in different hippocampal subregions between normal control group and MTLE-HS group

2.3 MTLE-HS 組患側、MTLE-HS 組對側與對照組海馬亞區的差異性

MTLE-HS組患側、對側之間海馬亞區CA1、CA2-3、CA4、GC-DG 的CBF 值 見 表1，采 用 配 對t檢 驗 得 出MTLE-HS 組患側CA1 與對側CA1 的CBF 值差異無統計學意義（t=1.075，P=0.289），其他亞區與對側相應亞區差異有統計學意義（P均＜0.001）。

對照組分別與MTLE-HS 患側組、MTLE-HS 對側組采用獨立樣本t檢驗進行差異性比較，發現無論患側還是對側與對照組相比，上述亞區CBF值差異均有統計學意義（P＜0.001）。

2.4 海馬各亞區CBF值ROC曲線及曲線下面積

ROC 曲線分析結果（表2、圖2）、DeLong 檢驗結果顯示海馬亞區CA1與CA2-3、CA4、GC-DG之間AUC差異有統計學意義（P＜0.05），CA2-3、CA4、GC-DG的AUC高于CA1，CA2-3、CA4、GC-DG 之間AUC 兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 海馬各亞區CBF值對HS的診斷效能Tab.2 Diagnostic efficacy of hippocampal subregion CBF values in hippocampal sclerosis

圖2 海馬CA1、CA2-3、CA4、GC-DG各亞區CBF值診斷HS的ROC曲線及其AUC。CBF：腦血流量；HS：海馬硬化；GC-DG：齒狀回顆粒細胞層。Fig.2 ROC curve and AUC of CBF value in CA1, CA2-3, CA4 and GC-DG regions of hippocampus for diagnosis of HS.CBF: cerebral blood flow; HS:hippocampal sclerosis; GC-DG: dentate gyrus granule cell layer.

圖3 男，18歲，癲癇病史3年，行“海馬杏仁核+標準前顳葉切除手術”，經病理證實為左側海馬硬化，預后良好。3A：斜冠狀位高清T2WI顯示左側海馬體積縮小，信號增高，顳角增寬，局部條紋模糊；3B：分割后海馬亞區感興趣區（ROI）；3C：腦血流量（CBF）圖與結構像T1配準，后將海馬亞區ROI映射到CBF圖像上，得出患側海馬CA1、CA2-3、CA4、齒狀回顆粒細胞層（GC-DG）區的CBF值分別為43.21 mL/（100 g·min）、40.81 mL/（100 g·min）、36.77 mL/（100 g·min）和40.61 mL/（100 g·min），血流灌注均比對側低；3D：左側海馬神經元染色陽性，海馬CA4區神經元丟失顯著，CA2-3區局部神經元排列紊亂，呈結節樣改變。Fig.3 Male, 18 years old, with a 3-year history of epilepsy, underwent ＂hippocampal amygdala and standard anterior temporal lobectomy＂, which was proved to be left hippocampal sclerosis by pathology, with a good prognosis.3A: The left hippocampal volume decreased, the signal increased, the temporal horn widened, and the local fringe blurred on oblique coronal high-definition T2WI; 3B: The segmented hippocampal subregion ROIs are shown; 3C: The cerebral blood flow (CBF)map is registered with the structural image T1, and then the hippocampal subregion ROI is mapped to the CBF image, the CBF values of CA1, CA2, CA4 and dentate gyrus granule cell layer (GC-DG) regions in hippocampus are 43.21 mL/(100 g·min), 40.81 mL/(100 g·min), 36.77 mL/(100 g·min) and 40.61 mL/(100 g·min),and the blood perfusion is lower than that on the side; 3D: Positive staining of neurons in the left hippocampus, the loss of CA4 neurons is significant, and the arrangement of local neurons in CA2-3 region is disordered, appearing as nodules.

3 討論

本研究利用3D-pCASL聯合海馬自動分割技術主要探討了MTLE-HS 患者海馬亞區的血流灌注改變。正常對照組左、右兩側CBF值在亞區級別血流灌注基本一致；對照組分別與MTLE-HS 患側組、對側組海馬各亞區CBF值比較，差異均有統計學意義；MTLE-HS組患側CA1 區與對側相應亞區的CBF 值差異無統計學意義。

3.1 海馬亞區概述及ROI勾畫方法的比較

海馬為雙皮層結構，其內部主要由阿蒙角和齒狀回組成。根據不同皮質發育差異及纖維排列的不同，將海馬分為四個亞區，即CA1～CA4。海馬本部為CA1～CA4，主要由錐體細胞構成，GC-DG 則主要由顆粒細胞構成[16]。ILAE 關于HS 的共識分類中定義HS分型：（1）1 型，各亞區均有細胞丟失，以CA1 和CA4 亞區中神經元丟失為主（＞80%），是臨床中最常見一種類型；（2）2型，以CA1亞區中神經元丟失為主，其他區丟失不明顯；（3）3 型，以CA4 亞區中神經元丟失為主（＞50%）[17-18]。

目前，針對海馬ROI勾畫的方法分為手動勾畫和自動分割[19]。手動勾畫耗時長，且不同測量者易造成較大的數值偏差，可重復性較差。因此本研究采用先進的腦部分割FreeSurfer軟件對海馬進行亞區級別的精細分割，其分割結果與手工分割相似[14,20-22]，且比手動勾畫更精細。GRIMM 等[23]比較了手動勾畫與自動分割相關性，結果表明在海馬區，FreeSurfer自動分割與手動勾畫的相關性較高，但依然存在一些差異，其原因與分割協議有關。亦有學者[24-26]報道，基于此方法可為難治性MTLE-HS患者手術前提供精確的定量分析。

3.2 海馬CA1區纖維投射及雙側海馬之間聯系

3.3 MTLE-HS患者血流灌注變化

CBF 值反映了腦中的血液灌注量，通常定義為每100克腦組織內每分鐘的血液毫升數[mL/（100 g·min）]。目前關于致癇灶的血流灌注變化，多數認同癲癇患者在急性發作期，由于病理性神經元活動性增高，細胞耗氧量增加，CBF 通常會增加；而在慢性發作間期，CBF 通常會減小，因為此時與正常腦組織相比，致癇灶區域的功能和活動較低[30-32]。本研究均收集發作間期HS 患者的CBF值，得出正常對照組左、右兩側CBF值在亞區級別差異無統計學意義，與既往手動勾畫海馬頭、體、尾測量海馬CBF值的結果一致[33]；擺玉財等[34]按照Coan的研究方法手動勾畫測量出正常海馬CBF值約為（53.78±7.19）mL/（100 g·min），本研究得出正常海 馬CA1、CA2-3、CA4、GC-DG 區CBF 值 分 別 為（50.444±6.683）mL/（100 g·min）、（58.926±9.188）mL/（100 g·min）、（55.911±8.985）mL/（100 g·min）和（55.117±8.332）mL/（100 g·min），兩者之間略有差異，這可能與樣本量的差異或ROI面積有關；ZHANG等[35]利用SPM 軟件中ASL toolbox 測量MTLE 患者海馬區CBF 值，結果顯示HS 患者血流灌注明顯低于對照組，HS 組患側與對側之間血流灌注不對稱；LI 等[9]通過3D-pCASL 技術手動勾畫海馬ROI 測量整體CBF 值，證明了HS 患側組、健側組海馬區CBF 值均低于正常對照組，與本次研究中對照組與MTLE-HS 組患側、對側在海馬各亞區CBF值比較結果一致。

當一側海馬病變血流減低時，對側海馬早期由于代償機制血流灌注會有所增加，但隨著患側HS 病情的加重，對側海馬也會出現因失代償致血流灌注減低。本研究中MTLE-HS組患側和對側、對側和正常對照組之間比較海馬各亞區CBF 值證實了雙側海馬之間存在聯系；我們發現當一側海馬血流灌注異常時，對側海馬CA1 區CBF 值降低得更為明顯，其原因可能與上述重要的纖維連接通路有關，同時VAN STAALDUINEN 等[27]在研究中提及CA1 區對缺氧具有特定的敏感性，被稱為“易損區”，故本研究認為對側海馬CA1 區CBF 值降低可能與其特定屬性也有一定關聯。在40例MTLE-HS患者中，患側各亞區CBF值均低于對側的有15 例，我們認為這類HS 的患者致癇灶局限在患側，未通過纖維傳導影響到對側，手術結果更為理想；以對側CA1 區減低為主的有14 例，我們猜想該類患者已通過纖維傳導影響對側海馬，使其在功能學上發生改變，以CA1 區CBF 值變化最為顯著，這種患者手術切除后可能會影響其預后癲癇發作的頻率。

3.4 海馬亞區CBF值對HS的診斷效能

本研究還對海馬各亞區CBF 值對HS 的診斷效能進行分析，ROC 曲線分析結果顯示CA1 區CBF 值診斷HS 特異度最高，約91.67%，但其敏感度僅為50.00%，CA2-3、CA4、GC-DG 區的診斷效能之間差異無統計學意義，AUC 分別為0.831、0.837、0.830，其中當CA4 CBF值截斷值為50.11 mL/（100 g·min）時，其特異度為73.33%，敏感度為80.00%，陽性預測值為66.70%，陰性預測值為84.60%。

3.5 3D-pCASL 聯合海馬自動分割技術在不同診斷標準中的差異性

本研究收集的由病理證實為HS 的3 例患者中患側海馬亞區存在血流灌注的減低，其中患側各亞區血流灌注全部顯著減低的有2例；由“臨床癥狀學+腦電圖+MRI”三者聯合診斷為HS 的37 例中，28 例存在海馬亞區血流灌注減低，且以CA1 亞區減低最顯著，以CA4 區減低的頻數最多。由此可見無論是病理證實的HS 還是臨床診斷的HS，均存在患側海馬血流灌注減低的表現，二者之間具有一定的一致性。

3.6 本研究的局限性

本研究存在一定的局限性。首先，本研究中只有3 例經病理證實為HS，其余37 例為“臨床癥狀學+腦電圖+MRI”三者聯合診斷為HS，需在今后納入更多經病理證實的樣本數據來進一步驗證研究結果；其次，樣本量偏少，可能存在樣本數據偏倚問題，今后需納入更多研究對象來減少此類問題發生。

4 結論

綜上所述，本研究認為針對局灶性顳葉內側癲癇患者，測量其海馬亞區血流灌注對術前準確定位致癇灶及其影響區域有一定的意義，可為術前了解HS亞區的血流灌注變化提供影像學依據。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻聲明：陳兵設計本研究方案，對稿件重要部分進行修改；閆夢楠起草和撰寫稿件，參與資料的分析與解釋；李健、王一婷、擺玉財、李金芹參與數據收集、整理與資料的分析解釋，對論文學術內容的重要方面進行修改，其中李健獲得了寧夏回族自治區重點研發計劃項目和寧夏自然科學基金的資助；全體作者都同意發表最后的修改稿，同意對本研究的所有方面負責，確保本研究的準確性及誠信。