黃秋葵-火龍果酵素工藝優化及特性分析

趙 飛，孫 莉，劉雪梅，王曉敏，曲春婷，程延玲，王裴沛，孫傳榮，劉亞琦，張培欣，張晨昊，侯雨婷，李心茹

（1.濰坊科技學院賈思勰農學院，山東 濰坊 262700；2.山東省設施園藝生物工程研究中心，山東 濰坊 262700；3.中華全國供銷合作總社濟南果品研究所，山東 濟南 250220）

食用植物酵素含有多種生物活性物質，具有抗衰老、抗氧化、解酒護肝及提高機體免疫力等功效[1-4]。在酵素制備過程中起關鍵作用的是微生物，通過利用微生物的發酵作用將原料所含的物質進行轉化，將生成的分解代謝產物釋放于酵素中，使其含有豐富的風味成分；發酵微生物大多為益生菌，在發酵過程中產生有益的生物活性物質，從而使酵素具有一定的功能特性[5]。蔣增良等[6]研究了在天然條件下發酵葡萄酵素的體外抗氧化能力的變化，在發酵過程中其抗氧化性能總體呈現上升趨勢；蔡麗琴[7]研究表明發酵10～20 d 的混菌發酵獼猴桃酵素具有最佳的抗氧化能力。夏國燈等[8]以玫瑰花作為原料，采用復合乳酸菌發酵，優化其發酵工藝，結果表明玫瑰酵素液發酵后的抗氧化能力較強。洪厚勝等[9]以葡萄渣和糖蜜等為發酵原料，優化接種酵母菌、乳酸菌和醋酸菌發酵的酵素工藝，制作出有機酸豐富、香氣成分突出和色澤鮮亮、口感、風味具佳的酵素產品。利用接種發酵制備果蔬酵素，研究其發酵過程中代謝產物的變化規律，從而優化產品品質，并為發酵生產提供了技術指導和理論支持。

黃秋葵（Okra Hibiscus esculentusL.）又名咖啡黃葵、秋葵、洋角豆，是錦葵科秋葵屬（Malvaceae genera）一年生食藥兩用的草本植物，是具有較高營養價值和藥用價值的新型保健蔬菜[10]，起源于非洲和亞洲等熱帶地區，目前在我國南方和北方地區均有種植[11]。黃秋葵含有果膠、多糖、蛋白質、可溶性膳食纖維、維生素和微量元素等營養物質[10-13]。但黃秋葵蒴果成熟期短，肉質易老化、纖維化，食用價值降低，需及時采收并進行深加工。目前黃秋葵主要被加工為凍干果干、凍干果粉、復合果蔬汁和保健袋泡茶等初級產品[10]，而對黃秋葵酵素方面研究較少。因此，本研究以黃秋葵為原料，采用接種乳酸菌的發酵技術，優化黃秋葵酵素的發酵工藝，測定酵素的總酸、pH值、可溶性固形物含量、色深和色調、色差、羥基自由基清除能力等，以期為實現黃秋葵酵素的工業化生產、綜合性開發以及品質的提升提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵，購自山東濰坊壽光；檸檬，四川安岳；紅心火龍果，市售。乳酸菌，5 菌型：保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌，北京川秀科技有限公司；冰糖，市售。

酚酞，西隴科學股份有限公司；乙醇，天津富宇精細化工有限公司；水楊酸，天津永大化學試劑有限公司；過氧化氫、氫氧化鈉，煙臺市雙雙化工有限公司；硫酸亞鐵，天津恒興試劑制造有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

二列八孔電熱恒溫水浴鍋，龍口市先科股份有限公司；C21-WT2112T 電磁爐，美的生活電器制造有限公司；YP502N 電子天平，上海精密科學儀器公司；T6 新悅-可見分光光度計，北京普析通用儀器公司；CS-410 分光色差儀，杭州彩譜科技公司；TD-45 數顯糖度儀，浙江托普云農科技公司；FE28 pH 計，梅特勒-托利多儀器公司；SJ-CJ-2FDQ 超凈工作臺，江蘇蘇潔凈化設備廠。

1.3 方法

1.3.1 黃秋葵酵素制備

挑選新鮮無損壞的黃秋葵、火龍果和檸檬，用無菌水洗凈、晾干、切塊后放入已滅菌的發酵罐中，添加滅菌冰糖，加入乳酸菌菌液（將乳酸菌菌粉溶于無菌水中，配置不同濃度菌粉液），進行避光靜態發酵[14]，以上所有操作均在無菌室中進行。

1.3.2 單因素試驗

（1）不同黃秋葵、火龍果添加比例對酵素品質的影響

控制冰糖添加量140 g/L，菌粉添加量0.75 g/L，發酵溫度35 ℃，發酵時間72 h，分別改變黃秋葵和火龍果的添加比例3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。發酵結束后對發酵液進行感官評價，確定最佳的黃秋葵和火龍果添加比例。

（2）不同發酵時間對酵素品質的影響

控制黃秋葵和火龍果的添加比例1∶1，冰糖添加量140 g/L，菌粉添加量0.75 g/L，發酵溫度35 ℃，分別改變發酵時間24、36、48、60、72 h。發酵結束后對發酵液進行感官評價，確定最佳的發酵時間。

（3）不同發酵溫度對酵素品質的影響

控制黃秋葵和火龍果的添加比例1∶1，冰糖添加量140 g/L，菌粉添加量0.75 g/L，發酵時間72 h，分別改變發酵溫度25、30、35、40、45 ℃。發酵結束后對發酵液進行感官評價，確定最佳的發酵溫度。

（4）不同菌粉添加量對酵素品質的影響

控制黃秋葵和火龍果的添加比例1∶1，冰糖添加量140 g/L，發酵溫度35 ℃，發酵時間72 h，分別改變菌粉添加量0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g/L。發酵結束后對發酵液進行感官評價，確定最佳的菌粉添加量。

1.3.3 酵素感官評價標準

邀請10 位感官評價員進行感官評價。以氣味、組織狀態、口感、色澤為評價指標，對黃秋葵-火龍果酵素進行感官評價，評分標準見表1[14]。

表1 感官評分表Table 1 Sensory score table

1.3.4 正交試驗法

在單因素試驗的基礎上，選取發酵時間、乳酸菌粉添加量、黃秋葵與火龍果添加比例、發酵溫度四個因素為自變量，進行四因素三水平的正交試驗，用以確定黃秋葵-火龍果酵素配方的最佳發酵工藝（見表2）。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.5 理化指標測定

（1）pH

用精密pH 計測定。

（2）可溶性固形物含量

采用數顯糖度儀測定。

（3）總酸含量

采用酸堿滴定法測定酵素總酸含量，依據GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》的方法測定[15]。

（4）羥自由基清除能力測定

取稀釋后的酵素樣品溶液2 mL，加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L H2O2溶液2 mL，混勻靜置反應10 min，再加入6 mmol/L 水楊酸乙醇溶液2 mL，混勻后置于37 ℃水浴鍋恒溫反應30 min，記錄波長510 nm的吸光值為Ai，用雙蒸水替代水楊酸溶液時測得吸光值為Aj，空白對照組以雙蒸水替代樣品溶液測得吸光值為A0，由公式（1）計算酵素對羥自由基的清除率[16]。

（5）色深、色調測定

參照蘭圓圓等[17]的方法稍作修改，進行酵素色深、色調的測定。取適量酵素移入1 mm 的比色皿中，采用紫外分光光度計分別測定酵素在420、520、700 nm 波長處的吸光值，并按照公式（2）（3）計算，所有的操作均重復3 次。

（6）色差測定

利用色差儀對酵素溶液進行測定[18]，色差值以L*（明度）、a*（紅綠值）、b*（黃藍值）、和ΔE*（總色差）表示。

1.4 數據處理

運用Origin 8.5 繪制圖表，SPSS 23.0 軟件執行Duncan 方差顯著性分析，數據結果用“平均值±標準差（SD）”表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同黃秋葵與火龍果比例對酵素品質的影響

由圖1 可知，黃秋葵與火龍果添加比例不同，酵素的感官品質出現明顯差異。當火龍果的添加比例較大時，酵素口感甜膩、不順滑；當黃秋葵添加量較大時，酵素黏稠度較大，顏色不透亮，發酵氣味濃郁，有少量沉淀等；當黃秋葵與火龍果添加比例為1∶1 時，酵素清淡爽口，口感較好，感官評分最高（95 分）。因此，初步確定黃秋葵和火龍果最佳添加比例為1∶1。

圖1 不同黃秋葵與火龍果添加比例對酵素品質的影響Fig.1 Effects of addition quantitie of okra and dragon fruit on the quality of Jiaosu

2.1.2 不同發酵時間對酵素品質的影響

由圖2 可知，發酵時間越長，酵素感官評分越高；當發酵時間低于48 h，酵素口感微澀；當發酵時間為72 h時，酵素口感順滑，色澤透亮，狀態均勻；當發酵時間高于72 h 時，發酵液感官評分略微下降，主要是因為隨著發酵時間的延長，發酵液中的營養物質不斷被消耗，代謝產物不斷增加，導致乳酸菌的代謝能力降低，從而使酵素品質發生變化。發酵液中代謝產物，如有機酸，與其他產物在適宜條件下相互轉化，如花青素與有機酸發生酰基化、乳酸菌將蘋果酸轉化為乳酸和CO2等[19]，導致酵素感官評分略有下降。在發酵時間72 h 后，酵素口感差異不大，因此，黃秋葵-火龍果酵素的發酵時間應為72 h。

圖2 不同發酵時間對酵素品質的影響Fig.2 Effects of fermentation time on the quality of Jiaosu

2.1.3 不同發酵溫度對酵素品質的影響

由圖3 可知，隨著發酵溫度的升高，酵素感官評分先升高后較低。在不同的發酵溫度條件下，酵素感官評分有較大差異性。在35 ℃條件下時，酵素感官評分最高，口感最好。因為植物乳桿菌最適生長溫度范圍為30～37℃，溫度過高或過低，其生長代謝速度則會降低，導致酵素發酵不完全，口感較差[20-22]。因此，在黃秋葵-火龍果酵素發酵過程中，應選擇35 ℃作為最佳發酵溫度。

圖3 不同發酵溫度對酵素品質的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on the quality of Jiaosu

2.1.4 不同菌粉添加量對酵素品質的影響

由圖4 可知，隨著菌粉添加量的增加，酵素的感官評分不斷提高。當菌粉添加量大于0.75 g/L，感官評分逐漸降低，主要是因為菌粉濃度過高時，發酵液渾濁度增加，且酵素口感變差。當菌粉添加量為0.25 g/L 時，酵素口感偏甜；接種量為0.75 g/L 時，感官評分最高，口感最好。因此，以0.75 g/L 的菌粉添加量最合適。

圖4 不同菌粉添加量對酵素品質的影響Fig.4 Effects of inoculation amount on the quality of Jiaosu

2.2 正交試驗結果

通過使用Design 設計四因素三水平的正交試驗，以感官評分作為評價指標，由極差分析可知（表3），影響黃秋葵-火龍果酵素感官得分的主次順序為黃秋葵與火龍果比例（A）＞發酵時間（B）＞發酵溫度（C）＞菌粉添加量（D）；由感觀分析方法得出黃秋葵-火龍果混合果蔬酵素的最佳工藝為A2B2C2D2，即黃秋葵和火龍果添加比例為1∶1、發酵時間72 h、發酵溫度35 ℃、菌粉接種量0.75 g/L時。在最佳工藝條件（A2B2C2D2）下進行發酵制作的黃秋葵-火龍果酵素為玫紅色，色澤明亮，口感協調，酸甜適中，無雜質，且帶有黃秋葵和火龍果特有的香氣和滋味。

表3 正交試驗設計及結果Table 3 Design and result of orthogonal experiment

2.3 不同配比下的酵素性質分析

選取三個無雜質和沉淀、口感清甜且色澤明亮的酵素產品進行理化指標測定，各產品的發酵條件如下：產品1 的黃秋葵火龍果添加比例1∶2，菌粉添加量0.25 g/L，冰糖添加量100 g/L，發酵溫度25 ℃，發酵時間24 h；產品2 的黃秋葵火龍果添加比例2∶1，菌粉添加量0.50 g/L，冰糖添加量120 g/L，發酵溫度30 ℃，發酵時間48 h；產品3 的黃秋葵火龍果添加比例1∶1，菌粉添加量0.75 g/L，冰糖添加量140 g/L，發酵溫度35 ℃，發酵時間72 h；其中產品3 是在最佳發酵工藝條件下制作的酵素產品。

2.3.1 理化指標

酵素發酵過程實際上是酸化過程，酵素發酵成功的重要參考指標是pH 值，一般值在3.0～4.0。《酵素產品分類導則》（QB/T 5324—2018）中規定，食用植物酵素一般理化指標中，液態酵素pH≤4.5；半固態酵素pH≤4.5，以《分類導則》規定液態酵素pH≤4.5 的細則。由表4 可知，三種酵素產品的pH 值在3.55～4.07 之間，均符合食用植物酵素要求。在低pH 值的環境可以抑制有害菌的產生。植物乳桿菌為兼性異型乳酸菌，利用碳源代謝產生乳酸、乙酸和酯類等代謝產物。在黃秋葵-火龍果酵素發酵過程中，植物乳桿菌利用火龍果、黃秋葵及冰糖中含有的碳源代謝產生乳酸和乙酸等有機酸，從而使酵素pH值降低[21-22]。唐敏等[14]利用乳酸菌發酵桑椹制備的酵素pH 值也在3.0～4.0 之間。

表4 不同酵素理化指標Table 4 Physics and chemistry index of Jiaosu products

總酸度是評價產品風味的一項指標，酸性條件可以抑制細菌的產生和生長，從而延長產品保質期。由表4 可知，酵素的平均總酸含量為1.05%～1.88%。總酸可以對酵素的風味起緩沖和平衡作用。當酵素的總酸量較少時，產品寡淡，無后味；當總酸含量較多時，酵素口味刺激；當總酸含量適中時，酵素口味適中，綿甜醇滑。產品2和產品3 酵素香醇可口，適合制作酵素飲品。

由表4 可知，酵素產品的可溶性固形物含量為18.37%～23.5%。當酵素中可溶性固形物含量較低時，其口感寡薄，無層次感；而可溶性固形物含量較高時，其口感過甜，食用后胃部會產生不適感。經感官評價得出酵素產品3 的可溶性固形物含量最為合適，適合做酵素產品。

2.3.2 羥基自由基清除率

羥基自由基在人體內主要是由過氧化物負離子與過氧化氫反應生成，過量的自由基會對機體造成損傷。通過測定酵素的羥自由基清除率，探究黃秋葵-火龍果酵素的抗氧化能力，結果如表5所示。三種酵素產品對羥基自由基均具有清除能力，產品3 羥基自由基的清除率最高（74.04%）。因此，黃秋葵-火龍果酵素對羥基自由基清除能力具有高效性。

表5 不同酵素的羥基自由基清除率Table 5 Hydroxyl radical scavenging of Jiaosu products

2.3.3 色深、色調

由表6 可知，酵素產品3 的色深值最大，色調值最低，主要是因為其發酵溫度最高，發酵時間最長。曾光[23]研究發現影響酵素色深值變化的重要因素是溫度，溫度越高，色深上升的幅度也就越大，同時色調下降的幅度也增大。酵素的色深值和色調值主要與其發酵條件有關系，不同的果蔬比例、菌粉添加量、發酵時間等因素也影響黃秋葵-火龍果酵素液的色澤。

表6 不同酵素的色深值和色調值Table 6 Color depth and hue of Jiaosu products

2.3.4 色差

酵素產品的顏色變化主要與其色素物質的含量有關[24]。由表7所示，三種酵素產品的L*、a*和b*值不同，產品1 的L*值最大，說明其色澤最明亮，原因主要是酵素原料中火龍果的添加比例較大；酵素產品的a*值均為正值，說明其色澤均呈現亮紅色，而b*值均為負值，則說明在發酵過程中酵素的黃色在逐漸降低，藍色在不斷加深。ΔE代表顏色變化，值越大代表顏色變化越大，三個酵素產品的顏色變化都較大。由表7 的結果可知，發酵結束后，黃秋葵-火龍果酵素呈現亮紅色，賦予了酵素飲品獨特的顏色特征。

表7 不同酵素的色差Table 7 Color parameters of Jiaosu products

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗得到黃秋葵-火龍果混合果蔬酵素的最佳發酵工藝，即黃秋葵、火龍果添加比例為1∶1、發酵溫度35 ℃、發酵時間72 h、菌粉接種量為0.75 g/L。這些因素對黃秋葵-火龍果混合果蔬酵素品質的影響由大到小依次排列為黃秋葵、火龍果的添加比量＞發酵時間＞發酵溫度＞菌粉接種量。

依上述比例制成的黃秋葵-火龍果混合果蔬酵素產品，其總酸含量為1.88%，糖度值為23.5%，pH 值為4.07，羥基自由基清除率高達74.04%以上；不同發酵條件所得的酵素的色差、色調和色深存在差異性。通過對黃秋葵-火龍果酵素工藝的優化研究，可為黃秋葵酵素的工業化生產、綜合性開發以及品質的優化提供理論依據和技術參考，豐富了酵素產品種類，提高了黃秋葵的附加值。