絲瓜皮多酚的提取及抗氧化性研究

劉曉倩，陳佳宇，任文靜，郭 然，彭 琪，丁建英

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

絲瓜（Luffa aegyptiacaMiller）屬于葫蘆科的攀援草本植物[1]，別名為勝瓜、菜瓜，含有蛋白質、脂質、碳水化合物、鐵、鈣、磷、維生素B1及抗壞血酸等多種營養成分[2-3]。絲瓜皮可以作為中藥，具有清熱解毒、消炎、抗氧化、提高免疫力等功效[4,5]。相關研究顯示，絲瓜中含有多酚類物質[6]，主要由類黃酮類和酚酸類成分組成[7]；絲瓜皮中的多酚含量高于絲瓜果肉，其醇提物中總多酚含量為9.8 mg/g。而絲瓜皮作為絲瓜食用時的副產物常被當作廢棄物丟棄，利用率極低[4-5]，因此對絲瓜皮功能成分的提取及研究，可為絲瓜皮資源的開發利用提供基礎。

超聲輔助提取方法與傳統提取方法相比，利用其熱作用和機械作用，可以促使功能成分的溶出，因此可以縮短時間、提高得率[8]，用于多種功能成分的提取[4,9]，本文用超聲輔助提取方法提取絲瓜皮中的多酚，通過研究不同的提取溫度、時間、乙醇濃度和料液比對多酚提取率的影響，利用單因素結合響應面法對多酚提取工藝進行優化，確定最優的提取工藝，同時研究其抗氧化性，以期為絲瓜皮的開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮壽光絲瓜購于常熟大潤發超市。

沒食子酸，上海源葉生物技術有限公司；福林酚試劑、無水乙醇、無水碳酸鈉、1,1- 二苯基-2- 苦基肼自由基（DPPH）、抗壞血酸（VC）、水楊酸、硫酸亞鐵，國藥集團化學試劑有限公司；30%過氧化氫溶液，強盛功能化學股份有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RE-5205A 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器公司；SHZ-D（III）循環水式真空泵，上海力辰邦西儀器科技有限公司；TU-1901 雙光束紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；KH-100DB 超聲波清洗機，昆山禾創超聲儀器有限公司；HH-4 數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；TG16-WS 高速臺式離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 絲瓜皮多酚提取

絲瓜皮處理：將新鮮的絲瓜刮皮，刮下的絲瓜皮于陰涼處干燥24 h，再將絲瓜皮于60 ℃干燥至恒質量，磨成粉末，過60 目篩，置于4 ℃冰箱備用。

絲瓜皮多酚提取：稱取4 g 絲瓜皮粉末，倒入錐形瓶中，同時以不同料液比加入一定濃度的乙醇溶液，振蕩混勻，使絲瓜皮粉末與乙醇溶液充分混合，超聲功率為100 W，連續超聲提取一定時間，4 000 r/min 離心5 min，將上清液轉入旋轉蒸發儀進行濃縮，濃縮成原體積的1/4，得到絲瓜皮多酚濃縮液，備用。

1.3.2 單因素試驗

絲瓜皮超聲輔助法提取時，結合預試驗，將超聲提取的溫度、時間、乙醇濃度和料液比四個因素進行單因素試驗，提取溫度為20、30、40、50、60、70 ℃，提取時間為10、20、30、40、50、60 min，乙醇濃度為60%、65%、70%、75%、80%、85%，料液比（質量體積比）為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），依次比較不同因素下各水平對絲瓜皮多酚得率的影響，以期獲得超聲輔助提取絲瓜皮多酚的最佳水平[10]。

1.3.3 絲瓜皮多酚提取的響應面優化試驗

為進一步研究各因素的交互作用對多酚提取率的影響，采用響應面分析法優化提取工藝[11]。基于Box-Behnken 試驗設計，選擇對多酚提取率有影響的4 個主要因素乙醇濃度、提取時間、料液比、提取溫度進行4 因素3 水平響應面分析試驗，響應面設計水平見表1[12]。

表1 響應面設計因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface design

1.3.4 絲瓜皮多酚得率的測定

將1.3.1 得到的絲瓜皮多酚濃縮液5.0 mL加入25.0 mL容量瓶中，加水定容，取0.5 mL 置入50 mL 比色皿中，隨后向比色皿中加入1.0 mL 福林酚試劑，振蕩，使溶液充分混勻，再加入2.0 mL 10%碳酸鈉溶液，振蕩，靜置1 h。最后測定溶液在760 nm 下的吸光度，根據公式（1）計算絲瓜皮多酚得率[13]。

式中，Y為絲瓜皮的多酚得率，mg/g；m為絲瓜皮質量，g；n 為稀釋倍數；V為被測液體積，mL；c為多酚濃度，mg/mL。

1.3.5 絲瓜皮多酚對DPPH 自由基的清除作用

在試管中分別滴加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的提取液2 mL，再加入2.0 mL、0.2 mmol/L 的DPPH 溶液，充分震蕩，避光靜置30 min。以無水乙醇調零，在517 nm 波長下測得吸光度值；把DPPH 溶液換為無水乙醇，作為對照測其吸光度值；取相同體積DPPH 溶液和無水乙醇混合，測其吸光度值。按照上述步驟，將抗壞血酸作為參照物[14]，測定其吸光度值。以上述操作平行3 次，取平均值。用公式（2）計算多酚對DPPH 自由基的清除率。

式中，A樣品為提取液和DPPH 溶液的吸光度值；A對照為提取液和無水乙醇的吸光度值；A空白為無水乙醇和DPPH 溶液的吸光度值。

1.3.6 絲瓜皮多酚對羥基自由基的清除作用

在試管中分別滴加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 提取液2 mL，再加入9 mmol/L FeSO4溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液各2.0 mL，充分震蕩，靜置5 min 再加入9 mmol/L 水楊酸溶液2.0 mL，充分震蕩，放置于水浴鍋中37 ℃恒溫水浴30 min。以蒸餾水調零，在510 nm 波長下測得吸光度值；把過氧化氫溶液換為蒸餾水，作為對照測其吸光度值；將提取液替換成蒸餾水作為空白對照，測其吸光度值[15]。按照上述步驟，將抗壞血酸作為參照物，測定其吸光度值。以上述操作平行3 次，取平均值。根據公式（3）計算絲瓜皮多酚對羥基自由基的清除率。

式中，A樣品為提取液和H2O2溶液的吸光度值；A對照為提取液和蒸餾水的吸光度值；A空白為蒸餾水和H2O2溶液的吸光度值。

1.4 數據處理方法

使用Excel 2010 進行數據處理及作圖。

2 結果與分析

2.1 絲瓜皮多酚提取單因素試驗結果

2.1.1 料液比對絲瓜皮多酚得率的影響

由圖1 可知，隨著絲瓜皮多酚提取體系中溶劑量的增加，絲瓜皮多酚的得率呈現先升高后下降的趨勢，這可能是由于溶劑的增加，使絲瓜皮多酚與溶劑中多酚濃度差增大，促進多酚的溶出。但當料液比超過1∶15 后，隨著溶劑量的不斷增加，多酚在濃縮后處理過程中損失增加[14-15]，使提取率下降。由此將料液比設定為1∶10～1∶20，作為后續響應面優化試驗的條件。

圖1 料液比對絲瓜皮多酚得率的影響Fig.1 Effect of material liquid ratio on the yield of polyphenols from luffa peels

2.1.2 乙醇濃度對絲瓜皮多酚得率的影響

如圖2所示，隨著乙醇濃度的增加，絲瓜皮多酚出現先增后減的趨勢。當乙醇濃度為60%～75%時，絲瓜皮多酚提取率呈明顯上升趨勢，在75%時達到最大值，這可能是由于乙醇濃度過低時，極性過強，導致糖類等水溶性物質浸出量增大；但在乙醇濃度為75%～85%時，得率逐漸降低，可能是乙醇濃度過高造成提取溶劑極性太低，導致蛋白質發生變性，使細胞壁結構變得致密，從而導致多酚不能溶出；另外多酚往往以氫鍵形式與其他成分結合，乙醇濃度過高，直接影響氫鍵的斷裂，使多酚提取得率下降[16]。因此，將乙醇濃度設定為70%～80%作為響應面優化試驗的條件。

圖2 乙醇濃度對絲瓜皮多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on polyphenol yield rate of luffa peels

2.1.3 提取時間對絲瓜皮多酚得率的影響

如圖3所示，當提取時間為10～30 min 時，絲瓜皮多酚得率隨提取時間增加而增加；當達到30 min 時，多酚得率達到最大值，為7.50 mg/g；提取時間達到30 min以后，多酚得率隨提取時間的增加而下降。可能的原因是多酚溶解于溶劑內需要時間，所以在30 min 之前，多酚得率呈上升趨勢；當達到30 min 臨界點時，多酚得率將不再增長，而且隨著提取時間延長，提取液中的多酚物質會發生氧化、聚合、分解等各種反應[17]，從而使其含量有所下降。由此將提取時間設定為20～40 min 作為響應面優化試驗的條件。

圖3 提取時間對絲瓜皮多酚得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on the polyphenol yield rate of luffa peels

2.1.4 提取溫度對絲瓜皮多酚得率的影響

如圖4所示，當提取溫度在20～60 ℃時，絲瓜皮多酚得率隨提取溫度的升高而上升，當提取溫度達到60 ℃時，達到最大值，為6.08 mg/g。這是因為隨著提取溫度的升高，分子運動加劇，從而使多酚析出增加；但溫度超過60 ℃，過高的溫度使多酚的化學結構破壞，從而使多酚得率下降[17]。由此將提取時間設定為50～70 ℃作為響應面優化試驗的條件。

圖4 提取溫度對絲瓜皮多酚得率的影響Fig.4 Influence of extraction temperature on polyphenol yield rate of luffa peels

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

響應面試驗結果如表2（見下頁）所示，利用軟件Design- Expert 10.0.3 對數據進行解析[18]，得到二次多項回歸方程：多酚提取率Y（%）=9.96+0.96A+0.87B+0.26C+109D+0 .37AB-0 .24AC+0 .30AD+0 .28BC-0.62BD+0.045CD-3.24A2-1.86B2-0.85C2-1.64D2。

表2 試驗設計與結果Table 2 Test design and results

對模型進行回歸分析，其結果見表3，一次項A、B、C、D 對多酚提取率線性效應顯著（P＜0.05），二次項A、B、C、D 對多酚提取率曲面效應顯著（P＜0.05），AB、AD、BD 對多酚提取率交互效應顯著（P＜0.05）。該模型的負相關系數R2=0.991 8，P＜0.000 1，可以證明該模型達到極顯著水平，該模型失擬項不顯著（P＞0.05），證明該模型可信，擬合度較高，可用于絲瓜皮超聲波輔助提取工藝的分析和優化。由F值可知，各因素對絲瓜皮多酚提取量的影響大小順序為提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間＞料液比。

2.2.2 因素間交互作用分析結果

由圖5（見53 頁）結合表3（見54 頁）可知，提取時間-乙醇濃度、乙醇濃度-提取溫度、乙醇濃度-料液比交互作用對絲瓜皮多酚提取率影響顯著（P＜0.05），其他因素交互作用對絲瓜皮多酚提取率影響不顯著。

圖5 各因素的交互作用對多酚提取率的影響Fig.5 The influence of the interaction of various factors on the extraction rate of polyphenols

表3 絲瓜皮多酚提取率擬合回歸方程的方差分析結果Table 3 Variance analysis results of the Prate fit regression equation

2.2.3 最優工藝條件試驗驗證

多酚最優提取工藝為乙醇濃度76.02%、提取時間30.19 min、料液比1∶15.75（g/mL）、提取溫度62.62 ℃，在此條件下模型預測的多酚提取率為10.24 mg/g。

根據軟件預測結果，結合實際工藝設置的可行性，取乙醇濃度76%、提取時間30 min、料液比1∶16（g/mL）、提取溫度63 ℃為條件進行三次重復試驗，平均多酚提取率為10.13 mg/g，與模型預測結果接近，表明模型擬合效果良好，基于該響應面模型分析優化多酚提取率提取工藝的方法有效可行[19]。

2.3 絲瓜皮多酚溶液的抗氧化能力分析結果

2.3.1 絲瓜皮多酚對DPPH 自由基的清除效果

酚類化合物是果蔬中主要的抗氧化物質之一，DPPH自由基被廣泛應用于天然植物或化合物的抗氧化能力評價。如圖6（見53頁）所示，絲瓜皮多酚與VC在消除DPPH自由基方面效果相近，其清除率隨溶液濃度的增加而增加，呈現正相關。當絲瓜皮多酚濃度為0.6 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除率為92.8%，顯示絲瓜皮多酚對DPPH 自由基具有良好的清除效果。有研究表明胎菊多酚對DPPH 自由基的清除率為97.49%[20]，與絲瓜皮多酚相當。

圖6 絲瓜皮多酚對DPPH 清除效果Fig.6 Effect of luffa peels on the effect of DPPH removal

2.3.2 絲瓜皮多酚對羥基自由基的清除效果

絲瓜皮多酚溶液與VC 溶液對羥基自由基清除效果如圖7所示，VC 與絲瓜皮多酚對羥基自由基具有清除效果，但通過數據對比發現，絲瓜皮多酚對羥基自由基的清除效果超過VC 對羥基自由基的效果。當絲瓜皮多酚濃度為0.6 mg/mL 時，對羥基自由基的清除率為88.17%。遠高于邵安冉等[20]報道的胎菊多酚26.42%的羥基自由基清除率，可見絲瓜皮多酚對羥基自由基具有較好的清除效果。

圖7 絲瓜皮多酚對羥基自由基清除效果Fig.7 Effect of luffa peels polyphenols on hydroxyfree radicals removal

3 結論

在構建資源節約型社會的進程中，農業生物廢棄物的再利用越來越受到人們的重視。本文以絲瓜食用后丟棄的絲瓜皮作為原料，采用超聲輔助乙醇提取的方法對絲瓜皮中的多酚進行提取，優化提取工藝參數，并對絲瓜皮多酚的抗氧化性進行了研究。得出絲瓜皮多酚超聲輔助提取的最佳工藝條件為乙醇濃度76%、提取時間30 min、料液比1∶16（g/mL）、提取溫度63 ℃。以此條件進行驗證實驗，得到絲瓜皮多酚得率為10.13 mg/g，與響應面模型預測值10.24 mg/g 相近。絲瓜皮多酚抗氧化性能研究發現，隨著絲瓜皮多酚濃度增大，絲瓜皮多酚對DPPH 和羥基自由基的清除率均不斷增加，絲瓜皮多酚濃度達到0.6 mg/mL 時，對DPPH 和羥基自由基的清除率分別為92.8%和88.17%，說明絲瓜皮多酚具有良好的抗氧化活性。絲瓜皮作為絲瓜烹飪或加工時產生的廢棄物，但其含有豐富的多酚成分，絲瓜皮多酚具有良好的抗氧化性，在食品加工以及化妝品行業有廣闊的應用前景，后續將對絲瓜皮多酚進一步純化并對其組分研究，為其進一步應用提供基礎。