槲皮素通過抑制支氣管哮喘大鼠miR-155表達重塑Th17/Treg細胞平衡的機制研究*

楊昊若 楊 斌

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種常見的慢性呼吸道疾病，嚴重影響患者的正常生活。根據(jù)流行病學調(diào)查顯示，近年來哮喘發(fā)病率不斷攀升，全球哮喘患者已達3.58 億，已成為全球性健康問題［1］。哮喘實質(zhì)是由多種炎性細胞和炎性介質(zhì)共同參與的慢性炎癥氣道反應，以氣道重塑和氣道高反應性為典型病理特征。輔助性T細胞（Th）是哮喘的氣道炎癥反應中重要的免疫細胞，其亞群Th1/Th2 的比例失調(diào)一直以來被認為是導致哮喘慢性氣道炎癥發(fā)生最主要的“罪魁禍首”。但隨著當前對Th細胞的研究日益增多，這種觀念已經(jīng)無法充分闡釋許多臨床試驗或預實驗的結(jié)果。近年來研究發(fā)現(xiàn)［2］，Th17 與調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）的比例關(guān)系在哮喘發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，Treg 細胞可分泌包括轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細胞介素-10（IL-10）等在內(nèi)的多種效應細胞因子以調(diào)節(jié)Th1/Th2的比例失衡，而與其同源的Th17 則通過分泌重要的促炎介質(zhì)白細胞介素-17（IL-17）發(fā)揮著完全相反的作用。二者相互拮抗，共同維持著免疫的平衡。micro RNAs（miRNAs）是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，以其對機體正常發(fā)育和免疫系統(tǒng)的重要調(diào)控作用為人們所熟知，而目前也已有相當數(shù)量的miRNAs 被證實在哮喘發(fā)病中起關(guān)鍵作用［3］。其中miR-155 是淋巴T細胞等多種免疫細胞發(fā)揮功能的必須miRNAs，其可通過多種信號通路及細胞效應因子調(diào)控Th17 和Treg 的分化，并在分子水平上調(diào)節(jié)兩者的平衡，因此在未來治療哮喘上將miR-155作為靶點具有很高的價值。

中醫(yī)藥在治療哮喘上相較西藥治療具有多途徑、多靶點、副作用少的顯著優(yōu)勢。槲皮素（Quercetin）是一種植物衍生出的黃酮類化合物，來源于柴胡、菟絲子、甘草、旋覆花等多種中藥材，具有止咳平喘和抗過敏等作用，在治療哮喘上取得了不錯的療效［4］。前期動物實驗發(fā)現(xiàn)［5］，槲皮素可通過抑制microRNA-155（miR-155）表達，有效減緩哮喘氣道炎癥反應。但目前尚無關(guān)于槲皮素是否可通過下調(diào)microRNA-155（miR-155）表達，從而促使Th17/Treg 平衡以減緩哮喘癥狀的研究，具體作用機制仍不清晰。本研究擬通過OVA 激發(fā)致敏建立大鼠哮喘模型，檢測槲皮素對哮喘大鼠IgE 及白細胞介素（IL-4、IL-5、IL-10、IL-17）水平、支氣管病理形態(tài)變化及microRNA-155（miR-155）、Th17/Treg 平衡的關(guān)鍵蛋白維甲酸相關(guān)孤兒受體轉(zhuǎn)錄因子（RORγt）、叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）表達，以期探索槲皮素對哮喘的治療作用及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康成年雄性SPF 級SD 大鼠60 只，體重150～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院實驗中心動物房，溫度20～24 ℃，濕度40%～60%。

1.2 藥物與試劑

槲皮素（美國Sigma，貨號PHR1488），卵蛋白（OVA）（美國Sigma，貨號A5503，批號BC88709X），Al（OH）3凝膠（美國Thermo Fisher，貨號77161，批號UE284411B），miR-155Antagomir 試劑（上海吉凱基因），地塞米松注射液（山東華信制藥，批號37021466），白細胞介素（IL-4、IL-5、IL-10、IL-17）ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物，批號分別為E-EL-R0014c、E-EL-R0558c、EEL-R0016c、E-EL-R0566c），蘇木素-伊紅染色試劑盒（北京索萊寶，貨號G1120），RORγt、Foxp3 單克隆抗體（美國Abcam，貨號分別為ab207028、ab215206），酶標山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物（北京中杉金橋，貨號PV6000），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR（美國Thermo Fisher）。402A 型超聲霧化器（江蘇魚躍），LS-3750 型全自動高壓滅菌器（日本三洋），LDZ5-2 型自動平衡離心機（北京京立），TP1020 型全自動脫水機（德國Leica），2016 型病理切片機（德國Leica），Olympus BX53型顯微鏡（日本Olympus），Image-Pro Plus 6.0（美國Media Cybernetics）。

1.3 模型制備

SD 大鼠分為正常組、模型組、地塞米松組、槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組、槲皮素+miR155 抑制劑組，每組10 只。除正常組外，其余各組于第1 天、第4天腹腔內(nèi)注射10%OVA+10%AH（OH）3的PBS混合液1 mL 致敏，第7 天將大鼠依次置于超聲霧化器中，1%OVA 霧化激發(fā)哮喘發(fā)作，空白組在相應時間點以PBS溶液代替OVA 進行腹腔注射及霧化吸入，當大鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、呼吸加快、腹肌痙攣、點頭呼吸或站立不穩(wěn)等，表明造模成功［6］。

1.4 給藥方法

地塞米松組每日給予地塞米松0.005 g/kg灌胃，槲皮素低、高劑量分別每日給予中藥0.75、3.0 g/kg 灌胃，槲皮素組+miR155 抑制劑組除了每日槲皮素3.0 g/kg灌胃外，同時以miR-155Antagomir 100 mg/kg尾靜脈注射，隔日1次，共3次。干預周期為2周。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 支氣管肺泡灌洗液（BALF）炎性細胞計數(shù)及分類 各組大鼠用2%戊巴比妥鈉麻醉，剪去頸部毛發(fā)后剪開皮膚，去除氣管周圍組織，在氣管上橫行切口，插入氣管插管。結(jié)扎右主支氣管，經(jīng)氣管插管以PBS溶液10 mL 分3 次灌洗左肺后回收BALF，2 000 r/min離心15 min，棄上清液，取沉渣經(jīng)生理鹽水重懸，吸取少量細胞懸液置血細胞計數(shù)板下計算細胞總數(shù)。Diff-Quik染色涂片后，行炎性細胞分類并計數(shù)。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血清炎癥介質(zhì)水平 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，分離一側(cè)頸總動脈，動脈取血5 mL，2 000 r/min 離心10 min，取上層血清，采用ELISA 檢測血清中IL-4、IL-5、IL-10、IL-17、IgE 的水平，具體操作嚴格依照相應試劑盒說明書進行。

1.5.3 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠支氣管病理學形態(tài) 取左肺組織固定于10%的甲醛溶液中，固定24 h，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 切片，HE 染色后，光鏡下觀察肺支氣管病理形態(tài)學變化。

1.5.4 免疫組化（IHC）染色觀察Foxp3、RORγ 蛋白表達 石蠟包埋后行厚度4 μm切片，烘箱70 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%H2O2避光10 min 滅活內(nèi)源性酶，枸櫞酸鹽修復液（pH6.0）高壓鍋熱修復3 min，滴加Foxp3、RORγ 抗體（濃度均為1∶200），4 ℃冰箱孵育過夜。次日PBS 沖洗后，滴加酶標山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物，常溫孵育30 min，DAB 顯色，鏡下控制反應時間，染色完成后自來水沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察，陽性信號為支氣管黏膜及肺泡上皮細胞棕黃色顆粒，陰性對照用PBS 代替一抗，每張切片隨機取5 個高倍視野（400倍），Image-Pro Plus 6.0軟件測定陽性信號的平均光密度（IOD）值。

1.5.5 RT-PCR 法檢測細胞中miR-155、Foxp3、RORγt表達 miR-155、Foxp3、RORγtmRNA 及內(nèi)參基因βactin 的引物采用Primer5.0 軟件設(shè)計，上海生工股份有限公司合成。引物序列為（miR-155 184 bp，上游5′-CCGTCGCTTCGGCAGCACG-3′，下游5′-GGCTAGCTTATGGCAGCC-3′；Foxp3 234 bp，上游-5′ACCTATGCCACCCTTATCC-3′，下游5′-GCTCCTCTTCTTGCGAA AC-3′ ；RORγt 150 bp，上游5′-CCTGGATGTGTAAAGAATG-3′，下游5′-TAGACTGCTAACGAATCTG-3′；β-actin 349 bp，上游5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′）。肺組織總RNA 提取按照試劑說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄后取cDNA。采用20 μL 體系，正反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，雙氧水6.4 μL進行擴增，反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共設(shè)40個循環(huán)。結(jié)果計算：LC480檢測得出的CT 值為cDNA 熒光強度達到所設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)，ΔCT=目的基因CT 值-內(nèi)參基因CT 值。每個樣品中mRNA相對表達量=2-ΔΔCT。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠BALF總細胞數(shù)及分類細胞計數(shù)比較

見表1。與正常組相比，模型組大鼠BALF 中總細胞數(shù)、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞計數(shù)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而與模型組比較，槲皮素高、低劑量組、地塞米松組、槲皮素+miR155 抑制劑組大鼠BALF 總細胞數(shù)、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)明顯降低（P＜0.05）。

表1 兩組大鼠BALF總細胞數(shù)及分類細胞計數(shù)比較（×105/mL，±s）

表1 兩組大鼠BALF總細胞數(shù)及分類細胞計數(shù)比較（×105/mL，±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別正常組模型組地塞米松組槲皮素低劑量組槲皮素高劑量組槲皮素+miR155抑制劑組n 10 10 10 10 10 10細胞總數(shù)5.01±0.83 18.13±2.01*9.85±0.94△12.86±1.62 10.73±1.31△9.31±1.46△中性粒細胞1.32±0.19 4.81±0.52*2.17±0.25△2.34±0.31△1.99±0.29△1.46±0.24△嗜酸粒細胞0.87±0.09 3.23±0.46*1.85±0.18△2.03±0.14 1.76±0.23△1.57±0.19△

2.2 各組大鼠血清炎癥介質(zhì)水平比較

見表2。與正常組相比，模型組大鼠血清IL-4、IL-5、IL-17 及IgE 水平明顯增加，IL-10 水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，槲皮素高、低劑量組及槲皮素組+miR155抑制劑組、地塞米松組IL-4、IL-5、IL-17 和IgE 水平減低，IL-10 水平上調(diào)，部分差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠炎癥介質(zhì)水平比較（ng/mL，±s）

表2 各組大鼠炎癥介質(zhì)水平比較（ng/mL，±s）

組別正常組模型組地塞米松組槲皮素低劑量組槲皮素高劑量組槲皮素+miR155抑制劑組n 10 10 10 10 10 10 IL-4 7.26±1.18 62.15±10.76*31.56±5.43△47.54±6.08 35.46±5.05△34.12±4.56△IL-5 12.34±1.47 58.45±10.47*30.34±4.32△43.53±5.28 29.21±5.16△28.66±4.41△IL-17 18.67±11.53 49.67±5.67*29.55±5.83△32.45±6.51△31.79±6.33△30.56±5.87△IgE 16.02±7.01 56.31±11.43*33.55±8.63△40.21±8.51 35.87±7.94△35.16±8.73△IL-10 23.83±4.32 7.65±1.73*13.19±4.15 16.87±3.79△17.12±4.31△17.77±3.87△

2.3 各組大鼠支氣管病理改變

正常組大鼠支氣管管腔內(nèi)管壁完整，未見上皮細胞脫落，無明顯炎癥細胞浸潤，支氣管黏膜平整，平滑肌呈正常厚度。與正常組相比，模型組大鼠支氣管管腔狹窄，管腔內(nèi)分泌物增多，管壁全層炎細胞浸潤，支氣管黏膜上皮脫落、變性，平滑肌層增厚明顯。與模型組相比，槲皮素高、中劑量組和地塞米松組及槲皮素+miR155 抑制劑組大鼠支氣管管腔內(nèi)黏液減少，支氣管黏膜上皮變性程度減輕，平滑肌增厚不明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠支氣管病理改變（HE染色，100倍）

2.4 各組大鼠RORγt、Foxp3蛋白的免疫組化結(jié)果

見圖2、表3。Th17/Treg 平衡的關(guān)鍵蛋白RORγt和Foxp3 在各組大鼠肺組織中均有表達，主要定位支氣管黏膜上皮及肺泡上皮。結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺組織內(nèi)RORγt表達水平顯著升高，F(xiàn)oxp3表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，槲皮素高、低劑量組大鼠肺組織內(nèi)RORγt 表達受到抑制，F(xiàn)oxp3 表達水平上升；地塞米松組與槲皮素高、低劑量組實驗結(jié)果趨同；相比其他干預組，槲皮素+miR155抑制劑組RORγt蛋白表達量下降，F(xiàn)oxp3蛋白表達量上升更顯著。以上結(jié)果差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肺組織RORγt、Foxp3蛋白表達（IHC，200倍）

表3 兩組大鼠肺組織RORγt、Foxp3免疫組化IOD值比較（±s）

表3 兩組大鼠肺組織RORγt、Foxp3免疫組化IOD值比較（±s）

組 別正常組模型組地塞米松組槲皮素低劑量組槲皮素高劑量組槲皮素+miR155抑制劑組n 10 10 10 10 10 10 RORγt 79.46±13.32 138.04±25.12*110.45±23.27△114.77±21.07△103.64±20.74△100.09±18.38△Foxp3 105.49±15.39 64.62±19.40*77.17±20.41 78.05±21.66 85.60±18.08△89.04±16.71△

2.5 各組大鼠肺組織RT-PCR 法檢測細胞中miR-155、Foxp3、RORγtmRNA表達結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠肺組織miR-155、RORγtmRNA 相對表達量顯著增強，F(xiàn)oxp3mRNA 表達減低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，槲皮素高、低劑量組、地塞米松組及槲皮素+miR155抑制劑組大鼠肺組織內(nèi)miR-155、RORγtmRNA表達明顯降低，F(xiàn)oxp3mRNA 表達活性明顯提升，部分差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠肺組織miR-155、RORγt、Foxp3mRNA含量相對表達值比較

3 討 論

哮喘是多種信號通路、炎性細胞、細胞因子共同參與的呼吸系統(tǒng)疾病，其實質(zhì)是慢性炎癥反應，以氣道高敏性和重塑為主要病理特征。哮喘發(fā)病時［7］，會引起嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、肥大細胞等炎性細胞活化并向炎癥部位聚集，釋放IL-4、IL-5、IL-17等炎性介質(zhì)，激活TGF-β/Smad3 等促炎通路，直接或間接損傷氣道上皮細胞，引發(fā)氣道炎癥。同時嗜酸粒細胞等炎性細胞會在炎性介質(zhì)的作用下過度活化，進一步產(chǎn)生病理損傷。因此，嗜酸粒細胞等炎性細胞總數(shù)也常用作臨床診斷哮喘的關(guān)鍵指標。中醫(yī)治療哮喘的歷史源遠流長，早在近兩千多年的《黃帝內(nèi)經(jīng)》中所記載的“喘鳴”就與本病發(fā)作特點相似，后經(jīng)歷代發(fā)展補充，最終將哮喘歸納為“哮病”的范疇。目前普遍認為其病機是肺失宣肅，主要表現(xiàn)為喘息、呼吸困難、咳嗽等肺系癥狀。槲皮素屬黃酮類化合物含多種藥理作用，具有抗炎、抗過敏、抗氧化、抗癌的作用［8］。先前研究發(fā)現(xiàn)［9］，槲皮素能夠有效緩解哮喘患者癥狀，提高患者生活質(zhì)量。本次實驗同樣發(fā)現(xiàn)，模型組相較空白組大鼠BALF 中中性粒細胞等炎性細胞總數(shù)更多，促炎分子IL-4、IL-5、IL-17 含量顯著上升，抑炎分子IL-10水平降低，支氣管出現(xiàn)嚴重病理損傷。而相比模型組，槲皮素相關(guān)劑量組及地塞米松組大鼠BALF 中炎性細胞總數(shù)均較模型組降低，IL-4、IL-5、IL-17水平與槲皮素劑量呈反比關(guān)系，IL-10 水平升高。根據(jù)HE 染色結(jié)果顯示，相比模型組，槲皮素相關(guān)劑量組及地塞米松組大鼠的哮喘病理損傷均得到不同程度改善，證明了槲皮素對哮喘的有效治療作用。

近年來多項研究均證明［10-11］，一方面Th17和調(diào)節(jié)性T 細胞及其效應因子本身就與哮喘關(guān)系密切，另一方面二者間的免疫失衡也在氣道炎癥和重塑這兩個重要哮喘病理進程中發(fā)揮極大作用。Th17 細胞作用主要通過其分泌的IL-17 實現(xiàn)，IL-17 是一種強大的促炎細胞因子，可以引起嚴重氣道炎癥，此外其還可與氣道平滑肌細胞（ASMC）上的受體結(jié)合，促進ASMC 增殖及遷移引發(fā)氣道重塑和高反應性。Treg細胞是一類可抑制或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的T 細胞，其分化數(shù)目的減少可導致多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生。其在哮喘中通過釋放IL-10，抑制嗜酸性粒細胞等炎癥細胞在氣道內(nèi)的浸潤，避免過敏反應和自身炎癥反應過度激活。RORγt、Foxp3分別是Th17細胞和Treg細胞重要的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子［12-13］。RORγt 可誘導Th17 細胞產(chǎn)生及分化并促進IL-17 的分泌，F(xiàn)oxp3 是Treg 細胞核中特異性轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控Treg 細胞分泌IL-10 等抑炎因子負性調(diào)節(jié)免疫反應。因此RORγt/Foxp3 的表達活性在維持Th17/Treg免疫動態(tài)平衡中的作用舉足輕重，即RORγt/Foxp3可調(diào)控Th17/Treg的免疫偏移。本此實驗結(jié)果顯示，槲皮素相關(guān)各劑量組Foxp3 蛋白的表達增強、IL-10 水平升高，RORγt 蛋白的表達量明顯下降、IL-17 水平降低，說明槲皮素可調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡。

miR-155是一種可調(diào)節(jié)機體免疫及炎癥的重要的microRNAs（miRNAs），因其是T 細胞、B 細胞等多種免疫細胞發(fā)揮生物學作用所必需的miRNA，所以在包括哮喘、肺纖維化、肺結(jié)核、慢性肺阻塞、肺癌等多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中，miR-155 均參與其中并發(fā)揮重要的作用［14］。在哮喘中miR-155 除可通過調(diào)節(jié)免疫細胞以影響疾病進程外，還可導致氣道上皮細胞和平滑肌細胞功能異常加重病理損傷。以往研究者們多聚焦于miR-155 通過削弱Th2 細胞過度激活恢復CD4+T 細胞的正常活化以治療哮喘的作用，而忽視了miR-155 通過調(diào)控Th17/Treg 細胞比例在哮喘致病中的重要作用。研究表明［15］，通過在CD4+T 細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-155 激動劑可以明顯提高Th17 和Treg 的比例并抑制Foxp3的表達，而在轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑后，CD4+T 細胞中Th17 和Treg 的比例則顯著降低，F(xiàn)oxp3 的表達明顯增強，提示miR-155 可增加Th17 的數(shù)目，減少Treg 的數(shù)目，同時削弱其免疫抑制的功能，實現(xiàn)對Th17/Treg 平衡的調(diào)控。那么槲皮素可否通過抑制miR-155 表達重塑Th17/Treg 失衡以發(fā)揮抗支氣管哮喘的作用呢？本實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素高劑量+miR155抑制劑組與槲皮素高劑量組（陰性對照組）相比，F(xiàn)oxp3 蛋白表達更強、IL-10 水平更高，RORγt 蛋白活性更弱、IL-17 的水平更低，表明槲皮素與miR-155 抑制劑合用能夠顯著抑制RORγt蛋白表達、減少IL-17分泌，增強Foxp3表達、促進IL-10 的分泌，以調(diào)節(jié)Th17/Treg 的免疫平衡。此外最新研究表明，Th17/Treg 動態(tài)平衡的地位在多種免疫紊亂的慢性炎癥中均舉足輕重，特別是在兒童患新冠肺炎后引起的兒童多系統(tǒng)炎癥綜合征（MIS-C）中，維持Th17/Treg 的免疫平衡可顯著改善炎癥病理進程［16］。而在肥胖與代謝性疾病中，Th17/Treg 似乎又是連接腸道微生物群與宿主代謝紊亂的橋梁［17］。再次說明了研究Th17/Treg免疫平衡的必要性。

綜上，槲皮素對哮喘擁有良好的治療作用。其通過抑制miR-155 表達，進而調(diào)節(jié)Th17/Treg 平衡可能是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵。本次僅通過相關(guān)細胞因子層面初探槲皮素對于下調(diào)miR-155 表達以重塑Th17/Treg 平衡的機制，仍存在許多不足，后續(xù)將進一步深入，從信號通路角度進一步探求其具體機制。