益氣活血生肌方對肛瘺術后急性感染性創面模型大鼠Vimentin、TNF-α和IL-4表達水平的影響*

張飛功 李猶龍 嚴 樺

（上海市靜安區閘北中心醫院，上海 200070）

肛瘺是因細菌感染肛門腺體及肛隱窩所導致的肛門部疾病，在臨床上屬于常見病、多發病［1］。肛瘺由于發病部位特殊，不易保持創面的清潔干燥，加之術后對肛緣皮膚黏膜的損傷，且伴隨著局部組織的壞死和滲出，使創面易于感染，導致病程較長［2-3］。中醫學中肛瘺術后創面感染屬“潰瘍”范疇，其病機為瘀血阻絡，氣血不通，失于濡養，導致創面水腫等，創面愈合緩慢，以益氣活血生肌為治法［4］。益氣活血生肌方具有清熱解毒、活血止痛、斂瘡生肌的作用，可達到緩解術后疼痛、水腫等并發癥，促進創面向愈的目的［5］。皮形蛋白（Vimentin）屬中間絲蛋白類，在中胚層起源的細胞中表達，如成纖維細胞、內皮細胞和白細胞等，其高表達可促進疾病的發展［6］。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可提高中性粒細胞的吞噬能力，促進中性粒細胞黏附到內皮細胞，刺激機體局部炎癥反應［7］。白細胞介素-4（IL-4）是一種重要的炎癥因子，具有活化B 細胞、刺激T 細胞增殖并參與炎癥反應等功能，從而加重肛瘺創面，延緩愈合［8］。為此，本研究探討益氣活血生肌方對肛瘺術后急性感染性創面模型大鼠Vimentin、TNF-α、IL-4表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠112只購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2020-0005，飼養于醫院實驗中心，體重280～340 g。于清潔動物實驗室飼養，操作過程符合動物倫理要求，動物飼養溫度20～28 ℃，相對濕度50%～60%，通風良好，環境安靜，實驗期間自由進食飲水，每日黑暗和光照各12 h。

1.2 試藥與儀器

益氣活血生肌方（黃芪20 g，太子參15 g，白術15 g，淮山藥15 g，當歸20 g，熟地黃10 g，丹參25 g，川芎15 g，薏苡仁20 g，茯苓10 g，甘草6 g）由醫院制劑室制備，水煎煮，合并2次濾液，定容至20 mL，每毫升相當于0.4 g生藥。濕潤燒傷膏，汕頭市美寶制藥公司；1%戊巴比妥鈉，上海上藥新亞藥業公司。酶標儀，日本Bio-Rad公司；臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；酶聯免疫檢測試劑盒，上海酶聯科研公司；隔水式恒溫培養箱，山東博科公司。Vimentin 蛋白單抗由上海易利生物科技公司，貨號：BLL101178E，批號：201911016。TNF-α檢測試劑盒，南京建成生物公司，貨號：ml002859，批號：201909023。IL-4 檢測試劑盒，信裕生物公司，貨號：xy-E10165，批號：201907028。

1.3 模型制備［9］

大鼠造模前禁水、禁食6 h，術前在脊柱兩側手術部位備皮，1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉。術區常規備皮、消毒，大鼠脊柱尾部的一側剪1 個約為2.0 cm×2.0 cm 大小的全層皮膚創面，切除皮膚全層深達肌層，并充分止血。空白組大鼠創面滴加0.2 mL 的生理鹽水，然后用油紗輔料覆蓋。實驗組、對照組大鼠皮膚創面分別滴加制備好的糞便混懸液1.0 mL，再加蓋醫用紗布包扎處理，之后把大鼠放回籠中等待麻醉蘇醒。每天兩組按同樣的步驟操作1 次，約5 d 后，如果有膿性分泌物，則表示傷口已發生急性感染。造模成功后，為防止相互舔舐及撕咬影響創面，每只大鼠單獨飼養。

1.4 分組與治療

將造模后的112 只大鼠按照隨機數字表法均分為4 組，分別為空白組、模型組、濕潤燒傷膏組和益氣活血生肌方組，每組28 只。各組大鼠均采用創面絡合碘消毒，生理鹽水沖洗創面。空白組：早晚用生理鹽水棉球清創后以無菌紗布覆蓋固定，并涂抹0.2 g 的凡士林膏。模型組：每日早晚用生理鹽水棉球清創并予以無菌紗布覆蓋固定。濕潤燒傷膏組：用濕潤燒傷膏油紗條覆蓋創面，再蓋無菌紗布固定，每日早晚換藥各1次，治療2 周。益氣活血生肌方組：用濕潤燒傷膏油紗條覆蓋創面，再蓋無菌紗布固定。按照成人體重70 kg為標準，換為大鼠所需劑量（g/kg）=成人所需藥量（g/kg）×6.3，再根據每100 g灌胃1 mL的標準計算，每只大鼠每天以3 mL 益氣活血生肌方湯藥灌胃治療，每日早晚換藥及灌胃各1次。各組均連續治療兩周。

1.5 觀察指標

1.5.1 創面愈合率 治療3、7、14 d后對創面面積進行測定：固定大鼠，創面周圍毛發進行修剪，將保鮮膜平鋪于充分暴露的創面上，用細中性記號筆在保鮮膜上畫創面標記，再將標記好的保鮮膜平鋪在心電圖紙張上，并對創面進行面積計算，最終算出愈合率。創面愈合率=（原創面面積-未愈合創面面積）÷原創面面積×100%。

1.5.2 肛瘺創面分泌物及水腫評分 治療后3、7、14 d對大鼠的肛瘺創面水腫評分進行測定：0 分為創面無水腫；1 分為創面少量分泌物，輕度水腫；2 分為創面中度水腫；3 分為創面分泌物較多，重度水腫。分值數越高表示創面分泌物與創面水腫越嚴重。

1.5.3 肛瘺創面肉芽生長評分 治療后3、7、14 d，對大鼠的肛瘺創面肉芽生長情況測定：0 分指肉芽紅潤顆粒狀，輕擦出血；1 分指肉芽色淡紅均勻，輕擦出血；2 分指肉芽色蒼白凹凸，擦之不出血；3 分指肉芽色晦暗，局部無肉芽，擦之不出血。分值數越高表示創面肉芽生長越差。

1.5.4 創面組織IL-4、TNF-α 表達水平 采用無菌刮勺于大鼠肛瘺創面上刮取1 g 的新鮮全層組織，-60 ℃保存。使用低溫勻漿器中放入0.3 g 組織，制成組織勻漿液，加入裂解液（PIRA）950 μL，再向勻漿液中加苯甲基硫酰氟溶液35 μL進行搖勻，20 min后4 ℃、12 000 r/min離心10 min后留取上清液。應用酶聯免疫吸附法（ELISA）進行檢測，對IL-4、TNF-α 表達水平測定，并嚴格遵守試劑盒（默賽飛公司）說明書操作。

1.5.5 Vimentin 蛋白檢測 采用蛋白免疫印跡法（WB）檢測Vimentin蛋白表達，分別在給藥后3、7、14 d，無菌條件下取創面中心至創緣間刮取新生肉芽組織，加入1 mL 的細胞裂解液，抽提各組組織中的總蛋白，并采用BCA 法測定蛋白濃度，取蛋白樣品SDS-PAGE凝膠電泳，然后全部轉移到PVDF 膜上，加入5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1～2 h。吸棄封閉液，TBST 洗膜3 次，加入用5%脫脂奶粉配制好的一抗工作液兔抗人Vimentin（1∶500），搖床上孵育1 h，4 ℃孵育過夜。回收一抗，用TBST 洗膜3 次，加入羊抗兔二抗工作液（1∶5 000），室溫孵育1～2 h。洗膜，放入自動顯影儀中曝光顯影，用Image J 軟件測出各組Vimentin 蛋白灰度值。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠肛瘺創面愈合率比較

見表1。治療3 d 后，各組的創面愈合率對比差異無統計學意義（P＞0.05），治療7、14 d 后，濕潤燒傷膏組和益氣活血生肌方組的創面愈合率明顯高于空白組（P＜0.05），益氣活血生肌方組的創面愈合率明顯高于濕潤燒傷膏組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠肛瘺創面治療愈合率比較（%，±s）

表1 各組大鼠肛瘺創面治療愈合率比較（%，±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與濕潤燒傷膏組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別空白組模型組濕潤燒傷膏組益氣活血生肌方組n7 7 7 7治療3 d 9.18±2.94 8.94±2.97 10.24±2.53 10.67±2.83治療7 d 37.53±4.61 24.39±6.78*54.29±5.29*#65.73±5.47*#△治療14 d 67.39±4.15 42.57±4.87*74.61±4.76*#97.9±5.43*#△

2.2 各組大鼠肛瘺創面分泌物及水腫評分、創面肉芽生長評分比較

見表2、表3。治療3 d 后，各組的大鼠肛瘺創面分泌物及水腫評分、創面肉芽評分對比無明顯差異（P＞0.05），治療7、14 d 后，濕潤燒傷膏組和益氣活血生肌方組的大鼠肛瘺創面分泌物及水腫評分、創面肉芽評分明顯低于空白組（P＜0.05），益氣活血生肌方組的大鼠肛瘺創面分泌物及水腫評分、創面肉芽評分明顯低于濕潤燒傷膏組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠肛瘺創面分泌物及水腫評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠肛瘺創面分泌物及水腫評分比較（分，±s）

組 別空白組模型組濕潤燒傷膏組益氣活血生肌方組n7 7 7 7治療3 d 2.61±0.18 2.63±0.22 2.57±0.18 2.46±0.20治療7 d 2.03±0.26 2.35±0.37*1.98±0.26*#1.17±0.18*#△治療14 d 1.62±0.23 1.97±0.29*1.28±0.32*#0.70±0.12*#△

表3 各組大鼠肛瘺創面肉芽生長評分比較（分，±s）

表3 各組大鼠肛瘺創面肉芽生長評分比較（分，±s）

組 別空白組模型組濕潤燒傷膏組益氣活血生肌方組n7 7 7 7治療3 d 2.41±0.40 2.43±0.43 2.39±0.45 2.31±0.44治療7 d 1.75±0.36 2.03±0.44*1.41±0.28*#1.15±0.19*#△治療14 d 1.46±0.31 1.64±0.38*0.98±0.45*#0.57±0.16*#△

2.3 各組大鼠肛瘺創面血清炎性因子水平比較

見表4。治療3 d 后，各組大鼠創面TNF-α、IL-4水平對比差異無統計學意義（P＞0.05），治療7、14 d后，濕潤燒傷膏組和益氣活血生肌方組創面TNF-α、IL-4水平明顯低于空白組與模型組（P＜0.05），益氣活血生肌方組的創面TNF-α、IL-4 水平顯著低于濕潤燒傷膏組（P＜0.05）。

表4 各組大鼠肛瘺創面TNF-α、IL-4水平比較（ng/L，±s）

表4 各組大鼠肛瘺創面TNF-α、IL-4水平比較（ng/L，±s）

IL-4 TNF-α組別空白組模型組濕潤燒傷膏組益氣活血生肌方組n7 7 7 7治療3 d 77.63±12.41 79.29±12.70*75.26±10.42*#74.96±11.23*#△治療7 d 72.61±8.12 76.84±7.49*63.19±6.42*#50.64±5.61*#△治療14 d 51.34±4.08 52.18±5.41*47.52±3.35*#38.24±3.12*#△治療3 d 59.28±8.07 60.13±8.11*56.12±6.75*#55.98±7.24*#△治療7 d 52.40±6.88 50.78±7.27*48.17±5.30*#39.22±4.51*#△治療14 d 44.62±5.03 46.28±5.17*37.26±4.22*#25.38±3.18*#△

2.4 各組肛瘺創面Vimentin蛋白表達水平比較

見表5。治療3 d后，各組的大鼠肛瘺創面Vimentin蛋白表達對比無明顯差異（P＞0.05），治療后7、14 d，濕潤燒傷膏組和益氣活血生肌方組的大鼠肛瘺創面Vimentin 蛋白表達明顯低于空白組（P＜0.05），益氣活血生肌方組的大鼠肛瘺創面Vimentin蛋白表達顯著低于濕潤燒傷膏組（P＜0.05）。

表5 各組大鼠肛瘺創面Vimentin蛋白表達水平比較（±s）

表5 各組大鼠肛瘺創面Vimentin蛋白表達水平比較（±s）

組 別空白組模型組濕潤燒傷膏組益氣活血生肌方組n7 7 7 7治療3 d 1.96±0.23 2.03±0.24 1.98±0.21 1.91±0.31治療7 d 1.69±0.21 1.86±0.27*1.44±0.19*#1.19±0.15*#△治療14 d 1.39±0.17 1.57±0.22*1.21±0.11*#0.78±0.09*#△

3 討 論

肛瘺是結直腸肛門外科的常見疾病，其主要治療手段為手術根治，可徹底排凈病灶膿液、減低疾病復發率，但為保證病灶的清除，往往造成創緣皮膚缺損，是肛瘺創面難愈合的重要原因［10］。此外，病灶位于消化道末端，糞便反復排出，且局部潮濕，得不到及時的處理，易致大量細菌聚集，誘發Vimentin 蛋白表達升高，引起炎癥等反應［11］。肛瘺術后創面受炎癥和外界因素的影響，易導致肉芽水腫、腐肉滋生、愈合時間延長等情況，此時，創面損傷區浸潤大量炎性細胞（IL-4、TNF-α）反應，也是造成肛瘺術后康復緩慢的重要原因［12］。術后早期干預創面的生長環境，減少組織壞死、減輕炎癥反應、加快腐肉脫落是有效促進肉芽組織重塑、肛瘺創面愈合的途徑［13］。因此，尋找有效促進肛瘺術后創面愈合的藥物，成為縮短肛瘺病程、減輕痛苦的有效辦法［14］。濕潤燒傷膏是一種油性藥膏，可在創面形成保護膜，避免神經末梢受到外界因素刺激，其不足之處在于揭去藥膏紗布時，可牽扯創面使剛剛愈合的創面再度撕裂，延長愈合過程。鑒于上述不足，本研究中加用益氣活血生肌方，以促進創面濕潤、有效改善創面微循環、加快創面恢復［15］。

中醫學認為肛瘺術后創面屬于金刃所傷的范疇，在肛瘺手術過程中，雖然去除了病灶的病變組織，但同時也會損傷到部分正常組織，從而使得機體氣血經絡受阻，血液瘀滯，創面局部的營養血供受到影響，因而也導致了創面愈合緩慢［16］。由此可知，肛瘺術后創面長期不愈合，可以辨證為氣滯血瘀、氣血虧虛證，因此我們制定了益氣活血生肌方［17］。本方采用益氣活血法為原則，健脾益氣、活血養血，使整個機體和局部的氣血及脈道調和通暢，即所謂“通則不痛”“榮則不痛”，從而緩解創面分泌物及水腫等并發癥，使肛瘺創面加快愈合［18］。本研究結果顯示，各組大鼠肛瘺創面治療7、14 d 后，益氣活血生肌方組的大鼠創面愈合率、創面分泌物及水腫評分均優于其他組，治療效果較好。說明益氣活血生肌方中藥治療具有增加創面微循環、加大毛細血管擴張、有效降低創面水腫、保持創面濕潤的作用。

現代藥理研究表明，益氣活血生肌方可使創面的微血管循環加快，進而使得肛瘺術后創面上的新生肉芽組織加快生長，有利于促進創面恢復［19］。其方中黃芪可抑制體內的自由基，可提高黏膜的免疫能力，對細菌起到抑制作用；太子參具有抗炎、抗菌的作用；白術可清除機體內自由基、調節免疫力，還可抑制炎癥、有抑菌的能力；山藥中的山藥多糖能增強免疫力，具有鎮痛、抗炎、抗刺激的作用；當歸可增加創面造血微環境的刺激，加速創面造血細胞的產生；熟地黃能夠抗炎、改善局部微循環；丹參能夠改善機體的微循環，具有鎮靜、鎮痛的功效；川芎可增加創面組織的周圍血管血流量，起到活血的作用；薏苡仁、茯苓可利水滲濕、排膿；甘草中和藥性，增強鎮痛、抗炎的作用［20］。本研究結果顯示，各組大鼠肛瘺創面治療7、14 d后，益氣活血生肌方組的大鼠創面中IL-4、TNF-α 表達水平低于其他組，其治療效果較優。說明治療肛瘺急性感染創面采用益氣活血生肌方治療，可抑制病原微生物生長，減輕炎癥反應，使生長因子聚集，促進創面愈合。

綜上所述，益氣活血生肌方治療肛瘺急性感染效果確切，可促進肛瘺術后創面愈合，減輕創面分泌物及水腫情況，改善創面Vimentin蛋白含量，降低創面組織中炎癥因子TNF-α、IL-4 水平表達，提高機體抗肛瘺感染的能力。