大孔樹脂富集丹參中丹酚酸B的工藝過程分析研究*

畢 赟 徐正圓 薛思敏 董靜怡 宋精梅 張宇燕

（浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053）

丹參是唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰等功效，是臨床和中藥新藥開發的常用中藥。丹參中丹酚酸B 含量較高，是丹參的主要有效水溶性成分［1］，活性較強，對心腦血管系統、肝臟、腎臟、肺都有保護作用，具有清除氧自由基、抗氧化、抗炎、抗纖維化等藥理作用，對調控心血管疾病有重要作用［2-3］。

大孔吸附樹脂是一種不溶于酸、堿及各種有機溶劑的高分子聚合物。在中藥現代化研究中，應用大孔樹脂分離富集中藥有效成分及中藥復方有效部位已越來越受到重視［4-7］。大孔吸附樹脂既可除去一些雜質以提高有效部位的純度，又可確保中藥制劑的穩定性和均一性。但因中藥及復方成分多且復雜，大孔樹脂對不同成分的吸附選擇性不同，使得復方藥效物質基礎的保留率相差也較大［8］。

本實驗采用常規制劑工藝提取采用的醇提法回流提取丹酚酸B，優化其提取工藝，采用大孔樹脂吸附法純化丹參提取液中的丹酚酸B，考察吸附洗脫過程中多個影響因素對純化效果的影響，分析其吸附原理。優化、分析后得到的提取純化工藝可為含有丹參的復方及丹酚酸B 的制劑的優化開發研究提供參考，可為進一步推進大孔吸附樹脂優化中藥復方及制劑工藝開發的研究，奠定較好的實驗和理論基礎。

1 材 料

紫外可見分光光度計（UV-2800/2802/2802S，上海恒科儀器有限公司）；電子天平（XS205，梅特勒-托利多儀器有限公司）。丹參（四川省中藥飲片有限責任公司，批號：200401）；丹酚酸B 對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：BJ0405QA18）；D201、D101、AB-8 大孔樹脂（天津市海光化工有限公司）；其余均為分析純。

2 方法與結果

2.1 建立丹酚酸B的含量測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備 丹酚酸B 干燥至恒重，精密稱取5.0 mg，70%乙醇溶解并定容至10 mL，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取丹參5 g，加8 倍體積的70%乙醇提取，過濾，濾液定容至100 mL，作為供試品溶液。

2.1.3 丹酚酸B 標準曲線的繪制 準確吸取不同體積的對照品溶液，制備成梯度濃度在287 nm 測定吸光度，計算得丹酚酸B標準曲線方程Y=0.021 6X-0.006 9（R=0.999 6）。

2.1.4 精密度試驗 取同一濃度對照品溶液，按照標準曲線繪制方法測定5 次，計算測得吸光度的相對標準偏差RSD=1.6%，表明丹酚酸B的精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取同一濃度對照品溶液，分別在時間點0、2、4、6、8 h 測定吸光度，計算RSD=1.5%，表明丹酚酸B在8 h內穩定性較好。

2.1.6 重復性試驗 按照供試品溶液的制備方法同步實驗5 次，測定吸光度，計算丹酚酸B 濃度的RSD=3.7%。

2.1.7 加樣回收試驗 稱取5 份相同質量的丹參，加入等量的丹酚酸B，按照供試品溶液的制備方法同步實驗6 次，測定吸光度，計算丹酚酸B 含量的平均回收率為104.72%，相對標準偏差RSD=4.41%。

2.2 丹酚酸B提取工藝的優化研究

采用L9（34）正交設計試驗優化提取工藝，分別考察影響丹酚酸B 提取得率的因素：提取次數、提取時間、乙醇濃度，按供試品溶液的制備方法，以丹酚酸B為指標，分析以上因素對丹酚酸B 提取工藝的影響。因素水平見表1，實驗結果見表2，統計分析見表3。結果表明3 個因素對丹酚酸B 提取的影響程度大小順序為C＞A＞B，最佳工藝條件為A3B2C1（即70%乙醇，回流2 h，提取1 次）。按照此最佳工藝條件，按照供試品溶液的制備方法重復實驗3 次，得到丹酚酸B 的平均含量為107.12 mg/5 g。

表1 丹酚酸B提取因素水平表

表2 丹酚酸B的正交試驗結果

表3 丹酚酸B正交方差分析

2.3 大孔樹脂純化丹酚酸B的工藝研究

2.3.1 樣品溶液的制備 丹參以70%的乙醇為溶劑，溶劑量為藥材體積的8 倍，回流2 h，提取1 次，測定丹酚酸B 含量為0.21 mg/mL。回收乙醇，用水溶解定容至等體積，作為上樣液。

2.3.2 大孔樹脂型號的選擇 取經預處理后的D201、D101、AB-8 型大孔吸附樹脂各10 mL，濕法裝柱。以1BV/h流速上樣，上樣結束后6 h靜置，用10 BV的70%的乙醇進行洗脫，測定計算洗脫液中丹酚酸B 的含量及其轉移率，重復3 次（轉移率=洗脫液中丹酚酸B 的含量÷樣品溶液中丹酚酸B 含量）結果見表4。本實驗選用D101型繼續開展優化研究。

表4 不同型號大孔吸附樹脂純化后丹酚酸B的轉移率（%）

2.3.3 上樣流速的優化研究 取預處理后的D101 型大孔吸附樹脂各5 mL，取丹參溶液各25 mL 以1、2、3、4、5 BV/h的流速上樣，上樣結束后6 h靜置。測定計算吸附后的溶液中丹酚酸B的含量及其轉移率。結果見圖1，最佳吸附流速為1 BV/h，隨流速增加，丹酚酸B的吸附效果明顯下降，5 BV/h有所回升。

圖1 上樣吸附流速對吸附的影響

2.3.4 靜態吸附時間的優化研究 按照最佳上樣濃度上樣后，分別觀察在吸附時間1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h 后的溶液中丹酚酸B 的含量及其轉移率。結果見圖2，最佳吸附時間為6 h。

圖2 上樣吸附時間對吸附的影響

2.3.5 上樣溶液pH 值的優化研究 將優化后上樣液分別調pH值為3、4、5、6、7，吸附6 h后測得丹酚酸B的含量及其轉移率，結果見圖3，最佳上樣樣品pH值為4。

圖3 上樣液pH值對吸附的影響

2.3.6 洗脫流速對解吸率的影響 將吸附飽和的大孔吸附樹脂各5 mL，先用蒸餾水洗滌，30%乙醇溶液100 mL除去懸浮物和雜質等，再用70%乙醇溶液100 mL進行洗脫，分別以1、2、3、4、5 BV/h 流速進行洗脫，取樣測定計算洗脫溶液中丹酚酸B的含量，再計算其轉移率。結果見圖4，最佳洗脫流速為1 BV/h。

圖4 洗脫流速對解吸率的影響

2.3.7 洗脫劑濃度對解吸率的影響 將吸附飽和的大孔吸附樹脂各5 mL，用蒸餾水洗滌，再用濃度為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液每種100 mL 以1 BV/h 的流速進行洗脫，測定計算丹酚酸B 的解吸率，結果見圖5，最佳洗脫乙醇濃度為70%。

圖5 洗脫濃度對解吸率的影響

2.3.8 大孔樹脂純化工藝的驗證 按照以上吸附、洗脫條件的優化結果，即上樣液pH 值為4，上樣流速為1 BV/h，吸附6 h，70%乙醇為洗脫劑，以1 BV/h 速度洗脫，洗脫液定容測定丹酚酸B的含量并計算其得率，結果得率為56.8%。

2.4 大孔樹脂吸附丹酚酸B的動力學分析

2.4.1 吸附動力學實驗 取預處理好的大孔樹脂10 mL裝入50 mL 錐形瓶中，加20 mL 樣品溶液在35 ℃的搖床振蕩器中，以100 r/min 的振速振蕩吸附，分別在2、5、10、15、20、30、40、60、90、120、180、300 min 收集溶液，測量并計算丹酚酸B 的含量，見表5。以吸附量為縱坐標，時間為橫坐標繪制吸附曲線，見圖6。

圖6 大孔樹脂吸附丹酚酸B的動力學過程

表5 大孔樹脂吸附丹酚酸B的動力學實驗結果

吸附量的計算公式：Qt=（C0-Ct）V/vM。

Qt為即時吸附量，Co為樣品溶液起始質量濃度，V為樣品溶液體積，v 為樹脂體積，M 為對照品丹酚酸B的摩爾質量，Ct為即時的溶液質量濃度。

2.4.2 吸附動力學方程擬合 運用準一級和準二級速率方程來擬合大孔樹脂對丹參溶液的吸附過程，再用Weber and Morris 顆粒內擴散方程對擴散機理進行分析［8］。采用以下方程對動力學過程的實驗結果進行擬合，分析大孔樹脂吸附丹酚酸B 的吸附過程。使用origin軟件對實驗結果進行分析，結果見表6。

表6 動力學模型擬合方程及模型參數

1）Lagergren 準一級速率方程：主要適用于固體-液體吸附體系的模型。

公式：ln（Q1-Qt）=lnQ1-K1t。

F 代表t時刻的吸附分數，Q1為一級吸附平衡時的吸附量，K1為一級速率常數。

以ln（Q1-Qt）對t 進行線性回歸，若R2＞0.9，可表明薄膜擴散是控制該吸附的因素。

2）準二級速率動力學方程。

公式：t/Qt=1/（K2×Q22）+tQ2。

Q2為二級吸附平衡時的吸附量，其中K2為二級速率常數。若R2＞0.9，可表明顆粒內擴散是控制該吸附過程的因素。

3）顆粒內擴散模型：Webber and Morris 等采用顆粒內擴散模型對吸附過程進行描述。

其中，K3為樹脂顆粒內擴散速率常數，C 為任意常數。以Qt對進行線性回歸，對實驗數據進行擬合，如果結果是過原點的一條直線，那么表明該吸附過程只受到一個過程影響，如果擬合結果為不經過原點的分段式曲線，那么表明這個過程受到兩種或多種擴散過程共同影響。

結果顯示準一級速率方程擬合中R2=0.97，準二級速率方程擬合中R2=0.99，表明該吸附過程采用準二級速率方程能更好擬合，準二級速率方程能更好描述該吸附過程。

本實驗中Webber and Morris 方程擬合得到的直線未過原點，說明吸附過程受到薄膜擴散和內擴散的共同影響，根據實驗結果的擬合曲線分成了2 段，第1 階段為薄膜擴散，第2 階段為內擴散，兩階段中的速率常數K3對比，第1階段的速率常數大得多，表明薄膜擴散為主要速率控制步驟。

3 討 論

丹參中丹酚酸B 具有組織修復及腦神經保護、促進記憶等作用［9-16］。傳統的中藥配伍提取常用溶劑為大量的水，丹酚酸B為水溶性成分，具有較重要的藥理活性，常作為質量標準指標之一［17-19］。中藥中分離純化技術，對中醫藥現代化進程的研究，包括制劑開發和中醫藥理論的現代闡述，具有重要的意義。中藥研究需要分離純化化學成分，也需要分離分析中藥產生藥效的科學理論依據，因此對丹參等中藥材開展分離分析的動力學原理研究非常有必要。

大孔吸附樹脂不僅理化性質穩定、選擇性好、吸附能力強，而且易洗脫、可循環使用，再生處理經濟環保，處理后能減小服用劑量和降低制劑的吸潮性、方便制劑成型，提高制劑穩定性等，已廣泛應用于中藥及其復方中活性成分的精制分離、去除有害雜質，得到了工業化推廣應用。由于中藥成分復雜多樣，各成分間的理化性質差別大，提取分離純化過程中也存在相互影響，導致動力學過程千變萬化，不同型號的大孔樹脂對同一成分的吸附性能不同，同一型號對不同成分吸附也不同，而且很難用一種樹脂對所有的中藥活性成分進行分離純化。大量研究表明，樹脂的型號、質量、安全性、穩定性及再生性方面還存在一些具體的技術問題，樹脂的吸附及洗脫工藝受多種因素影響，在工業化實際應用中需通過對每個成分或有效部位的優化研究確定最佳條件，才能符合工業化生成需要，同時不影響臨床療效。

本實驗通過正交設計優化丹參中丹酚酸B 的提取工藝，分析乙醇濃度、回流時間、回流次數等因素對丹酚酸B 提取過程的影響，得到最佳工藝條件：70%乙醇提取2 h，提取1 次。在此基礎上，通過吸附效果評價轉移率，篩選出D101型大孔吸附樹脂開展純化工藝研究，單因素考察上樣流速、靜態吸附時間、上樣溶液pH值、洗脫劑濃度、洗脫流速等因素的影響，優化最佳純化工藝條件為：上樣液pH 值為4，上樣流速為1 BV/h，吸附6 h，70%乙醇為洗脫劑，以1 BV/h 速度洗脫。大孔樹脂吸附丹酚酸B 動力學研究實驗結果表明，準二級速率方程能更好描述D101 型大孔吸附樹脂對丹酚酸B 的吸附過程，并且此過程受到薄膜擴散和內擴散的共同影響，且主要速率影響因素為薄膜擴散運動。本實驗優化得到的丹酚酸B 提取純化工藝條件，可為含有丹參的復方及丹酚酸B的制劑的優化開發研究提供依據，對吸附過程的動力學分析也有助于為中藥材的工業化、臨床配伍及中醫藥現代化研究提供參考。