蘆薈多糖對(duì)自身免疫性甲狀腺炎小鼠輔助型T 細(xì)胞亞群的影響

沈維亞，吳朝文

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AT）是一種常見(jiàn)的甲狀腺疾病，多發(fā)于中年女性，主要是由淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)且伴有自身抗體形成，導(dǎo)致患者的甲狀腺腫大、功能出現(xiàn)異常［1-2］。目前臨床患者癥狀較輕且治療AT 的藥物較少［3-4］，因此尋求一種治療AT 的藥物對(duì)臨床有著重要意義。蘆薈屬于百合科植物［5-6］，含有豐富的糖類、氨基酸、各種有機(jī)酸及蒽醌類化合物。其中蘆薈多糖占蘆薈凝膠的60%左右，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為線性的β-（1，4）-D 甘露糖作為基本單元組成的長(zhǎng)鏈聚合物。研究顯示［7］，蘆薈多糖具有抗腫瘤、抗輻射、抗菌消炎及抗?fàn)C傷等功效，還具有降低血糖及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。有研究顯示［8-9］，蘆薈多糖對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能有全面的調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)T、B 淋巴細(xì)胞的分化和增殖，同時(shí)增加T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并提高巨噬細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶、精氨酸酶活性，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體腫瘤壞死因子α 及白細(xì)胞介素1 等的釋放。本研究將對(duì)AT 小鼠模型進(jìn)行蘆薈多糖的治療，旨在分析蘆薈多糖對(duì)AT 小鼠的甲狀腺功能及輔助型T 細(xì)胞亞群的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料

將50 只健康無(wú)特定病原體的BALB/C 雌性小鼠（廣州市謹(jǐn)為生物科技有限公司，NIH 小鼠，動(dòng)物批號(hào)：JW019）隨機(jī)分為蘆薈多糖低、中、高劑量組、AT 組、對(duì)照組，每組各10 只，所有小鼠均為6～8 個(gè)月，體重在16～18 g。其中對(duì)照組小鼠均為健康小鼠，AT 組及蘆薈多糖低、中、高劑量組均為AT 小鼠，蘆薈多糖低、中、高劑量組采取藥物治療。本次小鼠研究均經(jīng)過(guò)深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：GDY1902240）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 使用豬甲狀腺球蛋白免疫聯(lián)合高碘水法建立小鼠AT 模型，主要方法如下：將豬甲狀腺球蛋白（porcine thyroglobulin， pTg）與等量體積完全弗氏佐劑制成終濃度為0.25 mg/ml 的油包水乳劑，并按50 μg/只，于小鼠背部皮下多點(diǎn)注射，1 次/周，連續(xù)2 周。第3 周后按50 μg/只，于背部皮下多點(diǎn)注射不完全弗氏佐劑與pTg 等體積制成終濃度為0.25 mg/ml 的油包水乳劑，1 次/周，連續(xù)3 周，同時(shí)每天飲用高碘水（劑量：0.63 mg/ml NaI），建立小鼠AT 模型。

1.2.2 蘆薈多糖提取 取新鮮蘆薈葉切成10 mm厚，干燥箱烘干（50 ℃，48 h）。粉碎機(jī)粉碎干燥的蘆薈片，制成蘆薈細(xì)粉，將蘆薈細(xì)粉置于黑色或棕色瓶中密封保存?zhèn)溆?。蘆薈多糖主要提取工藝如下：蘆薈細(xì)粉按料液比為1∶20（g/ml）復(fù)水，超聲處理（中國(guó)西門(mén)子有限公司SSA-770A，功率：800 W，時(shí)間：9 min），離心機(jī)離心［美國(guó)貝克曼勒特 OPTIMA XE-90，9 000 r/min（離心半徑為8 cm）15 min］，過(guò)濾，取濾液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮處理（0.08 MPa，60 ℃），濃縮至濃稠狀，再按體積比1∶4 加入無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜（4 ℃），離心10 min［2 500 r/min（離心半徑為8 cm）］，取沉淀物，即為蘆薈多糖。

1.2.3 治療方法 蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠分 別 灌 胃 給 藥150 mg·kg-1·d-1、300 mg·kg-1·d-1、600 mg·kg-1·d-1，而AT 組及對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃，連續(xù)治療4 周。

1.2.4 檢測(cè)方法 5 組治療4 周后麻醉小鼠，并對(duì)小鼠采用脊椎脫臼處理法處死，收集小鼠外周血，依據(jù)體重不同采集其體重的1%～3%，在0.2～0.6 ml，并置于室溫下6 h，然后采用醫(yī)用離心機(jī)，以3 000 r/min（離心半徑為8 cm）離心20 min，取上清液。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)所有血清樣本的促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone， TSH）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine， FT3）、游離四碘甲狀腺原氨酸（free tetraiodothyronine， FT4）。依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒購(gòu)自上海艾博生物科技有限公司（B11689-Hu）。

對(duì)于輔助T 淋巴細(xì)胞亞群，需取小鼠的外周血和脾臟組織，并分離外周血單個(gè)核細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液。室溫孵育半小時(shí)后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+CD8+IL-4+（白細(xì)胞介素-4， interleukin-4）輔助T 淋巴細(xì)胞和CD3+CD8+IFN-γ+（干擾素，interferon）頻率，試劑盒購(gòu)自上海艾博生物科技有限公司（CB10096-Hu）。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）比較蘆薈多糖低、中、高劑量組、AT 組、對(duì)照組小鼠的甲狀腺功能指標(biāo)水平：TSH、FT3 及FT4；（2）比較5 組小鼠外周血CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細(xì)胞和CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細(xì)胞水平；（3）比較5 組小鼠脾臟組織CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細(xì)胞和CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細(xì)胞水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，2 組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的甲狀腺功能指標(biāo)比較

在蘆薈多糖治療4 周后，蘆薈多糖低、中、高劑量組及AT 組小鼠的TSH 水平比對(duì)照組高，而FT3、FT4 水平較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。蘆薈多糖低、中、高劑量組較AT 組TSH 水平降低，而FT3、FT4 水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 蘆薈多糖低、中、高劑量組、AT 組、對(duì)照組小鼠的甲狀腺功能指標(biāo)（每組n=10）

2.2 各組小鼠外周血的輔助型T 淋巴細(xì)胞頻率比較

在蘆薈多糖治療4 周后，與對(duì)照組比較，AT組、蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠外周血的CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細(xì)胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細(xì)胞水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與AT 組比較，蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠外周血CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細(xì)胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細(xì)胞水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 蘆薈多糖低、中、高劑量組、AT 組、對(duì)照組小鼠外周血的輔助型T 淋巴細(xì)胞頻率比較（%，每組n=10）

2.3 各組小鼠脾臟輔助型T 淋巴細(xì)胞頻率比較

在蘆薈多糖治療4 周后，與對(duì)照組比較，AT組、蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠脾臟組織的CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細(xì)胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細(xì)胞水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與AT 組比較，蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠脾臟組織的CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細(xì)胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細(xì)胞水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 蘆薈多糖低、中、高劑量組、AT 組、對(duì)照組小鼠脾臟輔助型T 淋巴細(xì)胞頻率比較（%，每組n=10）

3 討論

AT 又稱為淋巴性甲狀腺炎，目前臨床研究表明環(huán)境因素及遺傳因素是導(dǎo)致AT 發(fā)病的主要原因，但其發(fā)病機(jī)制暫不明確［10］。相關(guān)文獻(xiàn)顯示［11-12］，目前我國(guó)有超過(guò)2 億的甲狀腺疾病患者，AT 患病率占總?cè)巳旱?%～2%，AT 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且缺乏有效的治療方法和藥物。本研究通過(guò)采取豬甲狀腺球蛋白聯(lián)合過(guò)量碘誘導(dǎo)產(chǎn)生AT 小鼠模型。本研究采用蘆薈多糖分高、中、低劑量3 組小鼠進(jìn)行4 周的連續(xù)治療，并采用生理鹽水同期灌喂AT 組及對(duì)照組，在甲狀腺功能檢測(cè)及輔助型T 細(xì)胞亞群檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)蘆薈多糖高、中、低組較AT 組血清TSH、FT3、FT4 均有明顯改善，且蘆薈多糖高、中、低組的CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細(xì)胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細(xì)胞水平較AT 組也有明顯降低。

多種報(bào)道顯示［13-14］，蘆薈多糖主要由半乳糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖及甘露糖組成，除抗?fàn)C傷、抗輻射等外，目前還發(fā)現(xiàn)可保肝、降糖及抗突變、艾滋病防治等新的藥理作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者表明［15］蘆薈多糖可通過(guò)調(diào)整Th1/Th2 細(xì)胞因子的水平而達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫抑制作用。機(jī)體內(nèi)，輔助型T 淋巴細(xì)胞主要分為T(mén)h1、Th2、Th17、Thαβ 輔助細(xì)胞，臨床資料表明［16-17］，Th1 輔助細(xì)胞主要參與細(xì)菌及原蟲(chóng)的免疫反應(yīng)，由IL-12 驅(qū)動(dòng)，而Th2 輔助細(xì)胞主要為對(duì)抗細(xì)胞外的細(xì)胞寄生蟲(chóng)的免疫反應(yīng)，由IL-4 驅(qū)動(dòng)。輔助T 淋巴細(xì)胞分化主要受機(jī)體的細(xì)胞因子的種類及水平所調(diào)控，且不同的T 細(xì)胞類型也會(huì)反過(guò)來(lái)影響其他細(xì)胞因子的分泌。本研究中蘆薈多糖可降低AT 小鼠的TSH 水平，同時(shí)升高FT3、FT4 的水平，且隨著蘆薈多糖的劑量增加，改善越明顯，說(shuō)明蘆薈多糖可明顯改善小鼠的甲狀腺功能，緩解其癥狀。同時(shí)進(jìn)一步分析小鼠外周血及脾臟組織時(shí)，發(fā)現(xiàn)蘆薈多糖可明顯降低AT 小鼠的CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細(xì)胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細(xì)胞水平，且隨著蘆薈多糖的劑量增加外周血及脾臟組織的 CD3+CD8+IL - 4+輔助 T 淋巴細(xì)胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細(xì)胞水平下調(diào)越多，表明蘆薈多糖可通過(guò)調(diào)控CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細(xì)胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細(xì)胞水平進(jìn)而降低IL-4 和IFN-γ 的分泌，緩解小鼠自身免疫反應(yīng)。

CD3 是T 淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)記物，CD4 和CD8則是T 淋巴細(xì)胞的亞群。CD4+T 淋巴細(xì)胞被稱為輔助性T 淋巴細(xì)胞，可以識(shí)別和激活其他免疫細(xì)胞來(lái)對(duì)抗感染和腫瘤。而CD8+T 淋巴細(xì)胞被稱為細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，可以直接殺死感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。IL-2R 是細(xì)胞因子IL-2 的受體，在T 細(xì)胞激活和增殖過(guò)程中起到重要作用。在甲狀腺炎的早期，CD4+T 淋巴細(xì)胞和IL-2R 的水平通常升高，而CD8+T 淋巴細(xì)胞的水平相對(duì)較低。這反映了體內(nèi)的免疫應(yīng)答正在發(fā)生，而CD4+T 淋巴細(xì)胞在這個(gè)過(guò)程中扮演了重要角色。在疾病進(jìn)一步發(fā)展時(shí)，CD8+T 淋巴細(xì)胞的活性可能會(huì)增強(qiáng)，同時(shí)CD4+T淋巴細(xì)胞的水平可能會(huì)下降。這反映了體內(nèi)炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步加重和對(duì)甲狀腺組織的破壞。蘆薈多糖可能通過(guò)不同機(jī)制調(diào)節(jié)這些免疫指標(biāo)的表達(dá)，從而影響AT 小鼠的免疫反應(yīng)。研究表明［18］，蘆薈多糖可能通過(guò)減少炎癥介質(zhì)的釋放，降低CD4+T 淋巴細(xì)胞的活性，并促進(jìn)CD8+T 淋巴細(xì)胞的活性，從而減少對(duì)甲狀腺組織的破壞。

綜上所述，在過(guò)量碘及豬甲狀腺球蛋白聯(lián)合誘導(dǎo)下建立的AT 小鼠模型，發(fā)現(xiàn)蘆薈多糖可有效改善AT 小鼠的甲狀腺功能，同時(shí)降低輔助型T 細(xì)胞亞群水平以抑制AT 小鼠機(jī)體內(nèi)的免疫反應(yīng)。需要指出的是本研究?jī)H對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究，受客觀條件約束未對(duì)具體的分子機(jī)制進(jìn)行研究，后續(xù)應(yīng)開(kāi)展多中心研究，為AT 的治療提供更有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。