綜合生物信息學、網絡藥理學、分子對接及實驗驗證探討補腎健脾方改善2型糖尿病的作用機制

蔡少鵬，鄭麗莎，蔡惠連，封杰妮，朱嫻瓊，高曉露，范巧明，楊慶依，季兵

（1.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510006；2.廣東祈福醫院，廣東廣州 511400）

糖尿病（diabetic mellitus，DM）發病率正逐年提高，一項全國性橫斷面研究結果表明，45 歲以上人群糖尿病患病率高達13.21%，其中，90%以上為2 型糖尿病（type 2 diabetic mellitus，T2DM）患者，且患病率隨年齡增長而增加[1]。T2DM 與酮癥酸中毒、心血管疾病等急慢性疾病高度相關，已成為威脅我國居民健康的重大公共衛生問題。然而，臨床上口服的降糖藥如雙胍類、促胰島素分泌劑、α-糖苷酶抑制劑多因胃腸道反應、營養與代謝障礙、過敏反應、肝功能損害等副作用而存在臨床局限性[2-4]。相對而言，中醫藥具有毒副作用小、綜合治療作用、可延緩并發癥等優點，隨著中醫藥現代化研究進程的加快，對抗T2DM 中藥復方的研究也愈加受到關注。有研究報道，中醫藥在抑制β細胞凋亡、修復β細胞功能等方面展現出光明前景[5-7]。本課題組前期臨床研究發現，補腎健脾方（淫羊藿、鹿角膠、黃精、沙苑子、制首烏、黃芪、山藥、葛根、丹參、制大黃）具有降低T2DM 患者空腹血糖[7]、糖化血紅蛋白[8-9]、穩態模型評估的胰島素抵抗指數（HOMA-IR）[10]等臨床療效，但其具體作用機制尚未明確。因此，本研究旨在通過聯合網絡藥理學、生物信息學、分子對接分析潛在的作用機制，并通過動物實驗驗證，以期進一步為臨床應用補腎健脾方治療T2DM 提供參考，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學研究

1.1.1 補腎健脾方化合物與相關靶點 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲取補腎健脾方中藥成分及對應的作用靶點，根據藥物動力學參數，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 進行初篩；同時，通過BATMAN-TCM 數據庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php/Home/Index/index）補充中藥成分及靶點，以默認參數進行篩選。通過UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）對靶點名稱進行標準化，轉化為gene symbol格式。

1.1.2 基因表達矩陣獲取 通過GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi）獲取基因表達矩陣：數據集GSE18732 基于GPL9486 平臺，包括118 個樣本，其中，T2DM 樣本45例，糖耐量異常（IGT）樣本26例，正常樣本47例；數據集GSE95849 基于GPL22448 平臺，包括18 個樣本，其中，T2DM 樣本6例，正常樣本6例，糖尿病神經病變樣本6例。為保證樣本的可對比性，本研究剔除了糖尿病神經病變樣本，僅12 例樣本被納入研究。通過GEOquery 包獲取基因集信息，并進行標準化處理。

1.1.3 Mfuzz分析 基因通常不是以“開-關”的方式進行調控，而是以漸進的方式，這樣可以對基因功能進行更精細的控制[11]。T2DM 是由正常血糖發展到IGT后再進一步轉變而來，因此，存在漸進性進展的改變過程[12]。與傳統硬聚類不同，Mfuzz 提供了一種軟聚類算法，通過區分一個基因的聚類程度來反映漸進性的變化規律。本研究以GSE18732 數據集樣本臨床信息為依據，根據“正常-IGT-T2DM”的轉變規律進行Mfuzz分析，獲取與T2DM 轉變過程同步變化的聚類，提取聚類基因用于后續分析。

1.1.4 差異分析 通過limma 包提取GSE95849 數據集，根據發病狀態進行差異分析，以|logFC|≥1且P＜0.05 為條件進行篩選，獲取T2DM 與正常樣本存在差異的基因。

1.1.5 藥物作用靶點獲取 分別提取“1.1.1”“1.1.3”“1.1.4”項中補腎健脾方的作用靶點及T2DM 發展過程同步變化的差異靶點，獲取交集靶點作為補腎健脾方的作用靶點，通過Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化。

1.1.6 GO富集與KEGG 通路 提取“1.1.5”項中補腎健脾方的作用靶點，通過clusterProfiler、org.Hs.eg.db 包進行富集分析，分別提取P＜0.05 的分子生物功能（MF）、生物過程（BP）、細胞組分（CC）和KEGG通路，預測補腎健脾方的作用機制。

1.1.7 核心靶點篩選 提取“1.1.5”項中的作用靶點，導入STRING數據庫（https://string-db.org/）獲取靶點的交互作用，隨后導入Cytoscape 軟件，通過MCODE 插件進行網絡分析，計算靶點的Degree、Betweenness、Closeness等信息，分別提取每個指標排前10 位的靶點，獲取交集靶點作為核心靶點，該靶點在網絡中具有優秀的核心影響作用。

1.1.8 分子對接 提取度（Degree）值最高的活性成分，與FOS、NOTCH1 進行分子對接。從Protein Data Bank（PDB）（https://www.rcsb.org/）數據庫下載核心靶點蛋白FOS（PDB ID：1A02）、NOTCH1（PDB ID：5L0R）的PDB格式（遵循：人源蛋白，分辨率及具有原始配體）。從TCMSP 數據庫、ZINC數據庫下載活性成分的mol2 格式。使用PyMOL 2.6.0 對靶點蛋白進行去水、去小分子配體，采用AutoDockTools 1.5.7 對靶點蛋白、活性分子加全氫后進行分子對接，通過PyMOL 對分子對接結果進行可視化處理。

1.2 實驗驗證

1.2.1 動物 4 周齡、體質量約20 g 的雄性db/db陽性小鼠8只，均購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動物生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0008。本動物實驗通過廣州銳格生物科技有限公司倫理委員會批準，倫理號：20220301-121。

1.2.2 藥物、試劑與儀器 補腎健脾方由淫羊藿12 g、鹿角膠15 g、黃精12 g、沙苑子15 g、制首烏15 g、黃芪30 g、山藥30 g、葛根30 g、丹參30 g、制大黃10 g組成，以上中藥飲片均購自廣東祈福醫院中藥房，加工成凍干粉。胰島素酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢基因美科技有限公司）；線粒體超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 試劑盒（廣州博輝生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒（上海酶研生物科技有限公司）；Bax抗體、Bcl-2 抗體、Caspase-3 抗體、山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋公司）；FOS 抗體、NOTCH1抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）。酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；RM2016 切片機（上海徠卡儀器有限公司）；DM500 光學顯微鏡（德國Leica 公司）；電泳及轉膜裝置（美國Bio-Rad公司）。

1.2.3 分組與給藥 將db/db 陽性小鼠隨機分為治療組和對照組，每組4只，適應性飼養1 周。治療組給予補腎健脾方凍干粉溶液9.95 g/kg 灌胃，對照組給予等體積生理鹽水灌胃，每日2次，連續給藥4 周。小鼠灌胃劑量計算方法：中藥按20%出粉率計算，補腎健脾方凍干粉人體用量為0.796 g·kg-1·d-1，按小鼠用藥量為人體用藥量25倍計算小鼠用藥量為19.9 g·kg-1·d-1。

1.2.4 觀察指標與方法

1.2.4.1 胰島功能及氧化應激指標檢測 灌胃4 周后，禁食不禁水6 h，斷頸處死小鼠。腹主動脈取血，血糖試紙檢測空腹血糖水平，按試劑盒說明書采用ELISA 法檢測空腹胰島素，并計算穩態模型評估的胰島素抵抗指數（HOMA-IR）：HOMA-IR=空腹胰島素×空腹血糖/22.5[13]。按試劑盒說明書采用ELISA法檢測SOD、MDA含量。

1.2.4.2 Western Blot法檢測小鼠胰腺組織內蛋白表達 取胰腺組織，裂解、離心，收集上清液。取10 μg 蛋白添加到聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離轉移到PVDF 膜上后封閉，分別加入一抗FOS 和NOTCH1 4 ℃孵育過夜，用TBST 洗滌3 次后加入二抗孵育，用ImageJ 軟件定量分析蛋白條帶的光密度洗膜，顯影。

1.2.4.3 免疫組織化學法觀察小鼠胰腺凋亡相關蛋白表達 取胰腺組織石蠟切片，脫蠟和水化，抗原修復，消除內源性過氧化物酶活性，封閉。分別與一抗Bax、Bcl-2、Caspase-3 于37 ℃孵育1～ 2 h，與二抗37 ℃孵育0.5～ 2 h，顯色后拍照。用ImageJ 軟件分析Bax、Bcl-2、Caspase-3 陽性面積百分比。Bax、Bcl-2 在細胞漿表達，Caspase-3在細胞漿和細胞核均有表達，呈棕黃色或棕褐色顆粒。

1.2.5 統計方法 運用R 4.1.3 軟件進行數據處理分析，計量資料用均數±標準差（）表示，組間差異對于符合正態分布的數據采用t檢驗，不符合正態分布的數據采用Wilcoxon 秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Mfuzz 分析隨著正常樣本從IGT 轉變為T2DM，聚類2、5 呈同步反向變化，聚類7 呈同步正向變化，見圖1。提取上述3個聚類共3 593個基因，其表達量與T2DM 的進展有同步變化關系，提示其可能為T2DM的關鍵生物標志物。

圖1 Mfuzz分析Figure 1 Mfuzz analysis

2.2 差異分析以|logFC| ≥1、P＜0.05 為條件進行差異分析，篩選得到差異基因2 997個，其中，上調基因2 834個、下調基因163個，見圖2。通過繪制韋恩圖，獲取與Mfuzz 分析結果的交集基因576個，見圖3。

圖2 火山圖Figure 2 Volcano plot

圖3 韋恩圖Figure 3 Venn diagram

2.3 “中藥-成分-靶點”網絡將補腎健脾方活性成分及其靶點與576 個T2DM 靶點取得交集基因77個，包括PROS1、FDXR、PYCR2、FOS等，提取交集基因相關的中藥成分信息導入Cytoscape 軟件構建網絡圖，見圖4。該網絡包括253 個節點和841條邊，根據Degree值篩選的核心成分主要有黃體酮（Progesterone）、γ-谷甾醇（Gamma-Sitosterol）、2-甲基腰果二酚（2-Methyl Cardol）、十五烷酸（Pentadecanoic Acid）。

2.4 GO 富集與KEGG 通路77 個基因用于GO 富集及KEGG 通路富集分析，提取P＜0.05 的富集結果。MF 主要富集于氧化還原酶的活性、輔酶結合等；CC主要富集于細胞-細胞接觸區、線粒體基質等；BP 主要富集于缺氧及其響應。KEGG 通路主要富集于T2DM、FoxO 通路、cAMP 通路等。可以發現，77個基因與氧化應激關系密切。見圖5。

圖5 GO富集與KEGG通路富集Figure 5 GO enrichment versus KEGG pathway enrichment

2.5 核心靶點篩選將77個基因導入STRING數據庫，去除無連接節點，其余參數默認，構建了一個63 個節點和117 條邊的網絡，通過MCODE 模塊分別計算節點的Degree、Closeness、Betweenness、MNC、MCC、EPC、EcCentricity和DMNC指標，分別提取前10個節點獲取共同交集靶點2個：FOS和NOTCH1。見圖6。通過對比可以發現，FOS 和NOTCH1 在T2DM 樣本中表達水平顯著高于正常樣本，見圖7。

圖6 花瓣圖Figure 6 Petal diagram

圖7 云雨圖Figure 7 Cloud and rain map

2.6 分子對接根據“2.5”項Degree 值排序，篩選了黃體酮（Progesterone）、γ-谷甾醇（Gamma-Sitosterol）、2-甲基腰果二酚（2-Methyl Cardol）、十五烷酸（Pentadecanoic Acid）作為主要活性成分，隨后將活性成分和核心靶點FOS（PDB ID：1A02）、NOTCH1（PDB ID：5L0R）進行分子對接，結合能見表1。結合能小于0，表明受體分子與配體分子能自發結合；結合能小于-1.2 kcal·mol-1，表明對接能力較強，對接后分子的穩定性較高。本研究對接結果顯示結合能均小于-1.2 kcal·mol-1，表明活性成分與核心靶點蛋白均能較穩定地結合。分子對接的可視化結果見圖8。

表1 結合能Table 1 Binding energy

圖8 分子對接的可視化結果Figure 8 Visualisation of molecular docking results

2.7 各組小鼠胰島功能比較干預后，治療組小鼠的空腹血糖、空腹胰島素水平、HOMA-IR 水平均顯著低于對照組（P＜0.05），結果見表2。

表2 各組小鼠空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR水平比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose，fasting insulin and HOMA-IR levels among each group of mice （）

表2 各組小鼠空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR水平比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose，fasting insulin and HOMA-IR levels among each group of mice （）

注：①P＜0.05，與對照組比較

2.8 各組小鼠血清SOD、MDA 比較經干預后，治療組小鼠的SOD水平明顯高于對照組（P＜0.05），而MDA水平則低于對照組（P＜0.01），結果見表3。

表3 各組小鼠血清SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of serum SOD and MDA levels among each group of mice（）

表3 各組小鼠血清SOD、MDA水平比較Table 3 Comparison of serum SOD and MDA levels among each group of mice（）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與對照組比較

2.9 各組小鼠胰腺組織FOS、NOTCH1表達比較干預后，治療組小鼠胰腺中FOS、NOTCH1 表達量低于對照組（P＜0.05或P＜0.01），結果見圖9。

圖9 各組小鼠胰腺組織FOS、NOTCH1表達比較Figure 9 Comparison of FOS and NOTCH1 expressions in pancreatic tissue among each group of mice

2.10 各組小鼠胰腺凋亡相關蛋白表達比較干預后，與對照組比較，治療組小鼠胰腺Bax、Caspase-3 陽性面積百分比降低（P＜0.05），Bcl-2陽性面積百分比升高（P＜0.05），結果見表4、圖10～圖12。

表4 各組小鼠胰腺凋亡相關蛋白表達比較Table 4 Comparison of the expressions of apoptosisrelated proteins in the pancreas among each group of mice（，%）

表4 各組小鼠胰腺凋亡相關蛋白表達比較Table 4 Comparison of the expressions of apoptosisrelated proteins in the pancreas among each group of mice（，%）

注：①P＜0.05，與對照組比較

圖10 Bax 的免疫組織化學染色圖（×100）Figure 10 Immunohistochemical staining of Bax（×100）

圖11 Bcl-2的免疫組織化學染色圖（×100）Figure 11 Immunohistochemical staining of Bcl-2（×100）

圖12 Caspase-3的免疫組織化學染色圖（×100）Figure 12 Immunohistochemical staining of Caspase-3（×100）

3 討論

2 型糖尿病（T2DM）的發病機制中，胰島素抵抗和胰島β細胞功能衰竭是兩個關鍵環節。在確診糖尿病時，糖尿病患者的胰島β細胞功能已下降至正常人的一半，而在糖尿病診斷前10～12年，β細胞數量已經顯著減少，并在此后逐年走向衰竭，正常的胰島β細胞則難以補償胰島素抵抗或不能再發揮這種補償機制，明顯加速了T2DM 病程[14-15]。有學者認為，胰島β 細胞衰竭源于凋亡異常增加[16]，抑制β 細胞凋亡對維持β 細胞數量及功能具有重要意義[17-18]。

胰島素抵抗狀態與糖尿病前期相關，糖尿病前期被認為是轉化為糖尿病的高風險狀態，在此期間活性氧（ROS）生成增加，增加的氧化應激誘導T2DM 及血管功能障礙等并發癥的發生發展[19]。氧化應激導致肌肉和脂肪細胞的葡萄糖攝取受損，并減少β 細胞的胰島素分泌[20]。Furukawa 等[21]通過使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制劑減少全身氧化應激，改善了肥胖小鼠模型中的葡萄糖代謝。Meigs 等[22]研究的數據顯示，胰島素抵抗的患病率與氧化應激標志物8-epi-PGF2α濃度呈正相關，這表明胰島素抵抗與非糖尿病患者和糖尿病風險升高的亞組如肥胖或空腹血糖受損（IFG）中的氧化應激相關。此外，在IFG 受試者中，與空腹血糖正常受試者相比，這種相關性更高[23-24]。可見，氧化應激誘導β 細胞功能障礙是誘導胰島素抵抗、促進IGT 與T2DM 的關鍵過程。然而，目前臨床抗T2DM 的治療藥物發揮降糖療效的同時，對受損的β細胞進一步刺激受損，缺乏促進β 細胞修復的功能，難以控制日漸衰退的β 細胞數量及功能[25-26]。相對而言，中藥“多靶點”治療優勢在改善糖尿病癥狀的同時對β細胞的保護展現出良好的應用前景，并逐漸受到臨床的廣泛關注。

T2DM 歸屬于中醫學“消渴”的范疇。“脾腎虛于內，標實于外”是T2DM 的發病進展原因。由于久坐、熬夜等不良生活方式及肥胖發病率的增長，目前臨床上以“三多一少”為典型表現的T2DM 患者越來越少，相反，以疲倦乏力、形體肥胖、脘腹脹滿、腰膝酸軟、舌淡胖有齒痕，苔薄白，脈沉細無力等脾腎虧虛證候居多。《靈樞·本臟》言：“腎脆則善病消癉易傷。”《石室秘錄·內傷門》言：“消渴之證，雖分上、中、下而以腎虛致渴，而無不同也。”腎為元陰元陽之臟，腎陰虧虛，無以上濟，虛火內生，精血化生失源，脈道不充，久病累及腎陽，不能溫養脾陽，加之飲食不節，脾陽受損，日久脾腎虧虛。《素問·經脈別論》言：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺……水津四布，五經并行。”氣血依賴于脾胃納運相得，因脾胃功能失常，水谷精微無法轉化為氣血輸布，食滯生痰、生熱、生瘀，進一步阻滯陽氣宣通，而病邪蓄積體內表現為血糖、血脂等升高。因此，血糖的升高是病邪“標實”的體現，脾腎耗竭是發病的根本，降糖等祛邪手段在短期內起效顯著，實則加重了“本虛”，如一線用藥二甲雙胍，其臨床療效受到普遍認可的時候，卻因其藥性寒涼，會出現腹瀉等脾陽受損加重的表現[27-28]；而磺脲類藥物降糖起效快且效果顯著，卻因過度耗損β 細胞，動搖了根本，導致本虛無以抗邪出現繼發性失效。因此，補腎健脾為治療T2DM的要點。

本研究綜合生物信息學及網絡藥理學，篩選出77 個補腎健脾方的作用靶點，通過富集分析，77 個靶點與氧化應激過程關系密切，并進一步篩選出2 個核心靶點FOS、NOTCH1，通過分子對接證明了補腎健脾方的主要活性成分與核心靶點結合穩定。最后，通過動物實驗證明了補腎健脾方可有效降低胰腺FOS、NOTCH1 表達，并降低脂質過氧化指標MDA，提高抗氧化指標SOD 活性，抑制凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達，促進凋亡抑制蛋白Bcl-2 表達，同時升高HOMA-IR。表明補腎健脾方通過降低胰腺FOS、NOTCH1 表達來緩解氧化應激，降低胰島細胞凋亡，改善胰島素抵抗以延緩T2DM的進展。

綜上所述，補腎健脾方可通過胰腺FOS、NOTCH1等發揮抗氧化應激改善胰島細胞凋亡，達到延緩T2DM 進展的目的，為其對T2DM 的防治提供了證據支持。