亞硝酸鹽對酸菜中菌屬微生物量的影響及相關性分析

魏振勇,李娜,孫全敏,王嚴,遲乃玉,張慶芳*

(1.大連大學 生命健康學院,遼寧 大連 116622;2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心,遼寧 大連 116622)

自古民以食為天,酸菜發酵在中國已經有3 000多年的歷史,從周朝開始就已經有了相關記載[1]。東北酸菜顏色金黃、味道酸香,含有有機酸和可溶性蛋白等大量的營養物質,具有抗氧化、抗炎、抗肥胖、抗癌、免疫調節等多種功能,其發酵菌種主要是乳酸菌,包括植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、腸膜明串珠菌屬(Leuconostocmesenteroides)等[2-3]。亞硝酸鹽(NIT)是常見的致癌物質之一,相比于其他食物,在腌制肉制品、泡菜及變質的蔬菜中含量較高[4]。有研究表明,正常成人食用0.2～0.5 g的NIT就可以導致中毒現象,如果超過3 g就會危及生命甚至導致死亡,NIT中毒引起的危害主要包括頭痛頭暈、惡心、腹痛、口唇皮膚黏膜紫紺,嚴重的還會引起高鐵血紅蛋白癥、肺水腫、心源性休克等[5-6]。

在發酵過程中酸菜勻漿理化指標及微生物量和種類對酸菜中揮發性成分、風味等尤為重要。Lin等[7]研究發現,Bacteroides、Lactobacillus、Lactococcus、Enterobacter等菌屬是產揮發性成分的主要物種。Liang等[8]研究發現植物乳桿菌和戊酸桿菌共接種發酵可提高酸菜中醇類、酯類、醛類、烴類和腈類的濃度。目前學者們專注于發酵體系中菌群結構以及多樣性的研究,利用相對豐度值變化來分析菌群的生長狀況,但采用相對豐度的分析方法忽略了微生物群落的數量和屬水平的樣本間差異,造成了分析結果的偏差[9]。Ruben等[10]研究發現,相對豐度的增加不一定與菌群的生長(絕對豐度的增加)有關,在發酵過程中可能會出現相對豐度減少,但絕對豐度不變甚至增大的情況。相關性分析將兩個或多個具備相關性的變量元素進行分析,衡量兩個變量因素的相關密切程度。遲雪梅等[11]對酸菜中pH、NO2-殘留量、亞硝峰值等指標進行相關性分析,研究發現勻漿最低pH值與菜中NIT殘留量相關性顯著。韓宏嬌等[12]研究發現酸菜pH與乳酸菌數、TAN呈極顯著負相關。乳酸菌會降解NIT,但NIT對乳酸菌等菌群的影響、酸菜中優勢菌屬微生物量與理化指標的相關性研究鮮有報道。

本研究以白菜為原料,采用小型獨立發酵體系進行發酵,制作多個獨立體系,每次取樣采用不同的體系,減少雜菌污染的問題,搖勻后取樣,避免了傳統上在發酵液上、中、下三層取樣的方式。測量發酵過程中理化指標及OD600 nm的變化,將不同發酵階段菌屬相對豐度與發酵過程中測定的OD600 nm的乘積作為微生物量,對菌屬微生物量與OD600 nm及理化指標進行相關性分析。探究東北酸菜不同發酵階段NIT對菌屬微生物量的影響,分析優勢菌屬微生物量與OD600 nm及理化指標的相關性,可對未來改善發酵過程、新型發酵菌劑的研發提供參考性意見。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

新鮮大白菜;硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氫氧化鈉、酚酞、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂(均為分析純):上海麥克林生化科技有限公司;DP812土壤基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒:天根生化科技(北京)有限公司;16S rDNA基因V3～V4區引物合成及建庫測序:由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2 儀器與設備

PHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;CRY-2112恒溫搖床 上海茸研儀器有限公司;DK-S26電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;Thermo Multiskan 1510酶標儀 芬蘭Labsystems公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-1200型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 東北酸菜自然發酵的制作工藝

1.3.1.1 工藝流程

選取新鮮大白菜→預處理(修整、清洗、燙漂、瀝水、切分)→裝瓶腌制→注鹽水→封蓋→25 ℃發酵→獲得成品。

1.3.1.2 操作要點

采用生漬法腌漬東北酸菜。挑選新鮮的大白菜清理好外層葉片,將白菜順著菜幫掰成若干片后,用清水清洗干凈,瀝干表面水分后將白菜切成0.5～1 cm的均勻細絲。注意保證不同部位的白菜細絲混勻,選用統一規格的555 mL PET為材料制備的東北酸菜發酵容器若干瓶,每瓶分裝160 g混勻的白菜絲,再注入1.5%的鹽水至滿瓶,最終形成封閉發酵體系,將全部酸菜放置于25 ℃恒溫培養箱中發酵,得到酸菜成品。

1.3.2 取樣

將自然發酵酸菜記為S組,添加NIT(亞硝酸鈉100 mg/L)為Y組。每瓶酸菜代表不同發酵時間點的獨立發酵體系,酸菜勻漿作為研究對象,以1 h為取樣起點,每隔12 h取出一瓶發酵菜進行理化指標(pH、TAN、NIT)及OD600 nm的測定,至發酵結束。

1.3.3 酸菜理化指標的測定及計算

將瓶內酸菜與發酵液倒入燒杯中,將其全部研磨后制成勻漿,分別稱取10 g酸菜勻漿作為待測樣品,進行理化指標的檢測[13-14]。pH的測定:使用pH計;TAN含量的測定:參照GB 12456-2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法;NIT含量的測定:參照GB 5009.33-2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法;OD600 nm的測定:采用紫外分光光度計測定在波長600 nm處的吸光度值。菌屬的微生物量=所代表菌屬的相對豐度×OD600 nm。以上所有實驗重復測定3次取平均值。

1.3.4 高通量測序

對S組和Y組的理化指標及OD600 nm進行分析,選取1 h、13 h、25 h、73 h、15 d 5個時間點的酸菜樣本,S組分別標記為 S1、S2、S3、S4、S5;Y組分別標記為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5;每個酸菜樣本3個重復。最后將選出的樣本進行16S rDNA高通量測序,按照土壤基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣本DNA,以其為模板,采用引物對338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行PCR擴增。

2 結果與分析

2.1 酸菜自然發酵體系OD600 nm、理化指標及相關性分析

2.1.1 自然發酵體系OD600 nm及理化指標

自然發酵(S組)過程中不同時間點酸菜樣本的OD600 nm及理化指標的變化情況見圖1。

圖1 S組發酵過程中理化指標及OD600 nm

由圖1可知,pH值整體呈下降趨勢,在發酵前期乳酸菌含量較少,產酸量低,pH下降緩慢,在13～25 h下降趨勢劇烈,然后逐漸平緩。馬歡歡等[15]研究表明,pH隨發酵時間的延長而下降,最終穩定在3左右,與本研究結果一致。總酸(TAN)、OD600 nm呈上升趨勢,Hu等[16]研究發現,發酵過程中TAN增長是由于乳酸菌產生乳酸等酸性物質,發酵時間為25 h時,達到亞硝峰,此時NIT含量為32.63 mg/L,此后NIT含量逐漸降低。

2.1.2 自然發酵體系OD600 nm及理化指標相關性分析

由表1可知,在1～73 h,S組的OD600 nm與TAN表現為正相關,pH與OD600 nm、TAN均表現為負相關,NIT與各理化指標及OD600 nm相關性較弱,其原因可能是前期既有NIT生成,又有NIT降解,進一步分析達到亞硝峰(25 h)后理化指標及OD600 nm相關性。

表1 S組在1～73 h理化指標及OD600 nm相關性分析

由表2可知,在25～73 h,S組的pH與NIT、OD600 nm與TAN均表現為正相關,NIT與OD600 nm、NIT與TAN、pH與TAN均表現為負相關,進一步添加亞硝酸鹽驗證整個發酵過程中理化指標及OD600 nm相關性。

表2 S組在25～73 h理化指標及OD600 nm相關性分析

2.2 酸菜添加亞硝酸鹽體系OD600 nm、理化指標及相關性分析

2.2.1 添加亞硝酸鹽體系OD600 nm及理化指標

添加亞硝酸鹽(Y組)發酵過程中不同時間點酸菜勻漿樣本的OD600 nm及理化指標的變化情況見圖2。

圖2 Y組發酵過程中理化指標及OD600 nm

由圖2可知,NIT影響整個發酵過程中的菌群濃度,使TAN含量整體偏低,其原因可能是一些不耐鹽的產酸菌生長受到抑制,導致pH值整體偏高,在13～37 h,NIT含量下降趨勢更劇烈。

2.2.2 添加亞硝酸鹽體系OD600 nm及理化指標相關性分析

由表3可知,在1～73 h,Y組的OD600 nm與TAN、pH與NIT均表現為正相關,pH與OD600 nm、pH與TAN及NIT與OD600 nm、NIT與TAN均表現為負相關。

表3 Y組在1～73 h理化指標及OD600 nm相關性分析

2.3 酸菜發酵過程中菌屬微生物量與OD600 nm及理化指標相關性分析

2.3.1 酸菜發酵過程中菌屬微生物量

利用OD600 nm來測量菌群在發酵階段菌體濃度作為該點樣本中微生物的相對總數,并與高通量測得的各菌屬的相對豐度相乘得出更準確的各菌屬的相對數量,因此各菌屬的微生物量(積累量)為所代表菌屬的相對豐度與OD600 nm的乘積。選取菌群中相對豐度前九的優勢菌屬進行微生物量分析(見圖3),在S組中,Lactococcus、Leuconostoc在發酵過程中相對豐度變化均呈先上升后下降的趨勢,但其微生物量始終保持上升趨勢。Lactobacillus的相對豐度在S5階段是S3階段的2倍,但其微生物量在S5階段是S3階段的7倍。在Y組中,Lactococcus、Leuconostoc的相對豐度在Y3～Y4階段變化差值分別為2.07%、0.04%,但Lactococcus的微生物量在Y4階段是Y3階段的2.46倍,Leuconostoc的微生物量在Y4階段是Y3階段的2.38倍;Lactobacillus在各發酵階段相對豐度、微生物量都微小且無明顯變化。因此可知添加NIT對Lactococcus、Leuconostoc的生長有促進作用,但對Lactobacillus的生長有抑制作用。在發酵過程中出現的有害菌屬如uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae,其微生物量Y組始終低于S組,說明NIT可以抑制某些有害菌的生長。

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2.3.2 酸菜勻漿中菌屬微生物量與OD600 nm及理化指標的相關性分析

選取1 h、13 h、25 h、73 h、15 d時間點優勢菌屬微生物量與OD600 nm及理化指標進行相關性分析,結果見表4。

由表4可知,在S組中OD600 nm與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc、Lactobacillus相關性系數分別為rs22=0.884 5,rs24=0.929 3,rs25=0.930 8,rs27=0.896 9,相關性大小順序是|rs25|>|rs24|>|rs27|>|rs22|;TAN與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關性系數分別為rs32=0.931 1,rs34=0.962 8,rs35=0.964 9,相關性大小順序是|rs35|>|rs34|>|rs32|;pH與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關性系數分別為rs42=-0.954 7,rs44=-0.962 7,rs45=-0.952 1,相關性大小順序是|rs44|>|rs42|>|rs45|。各菌屬微生物量與NIT相關性較弱,可能是25 h的亞硝峰導致的,進一步在Y組中進行分析。

由表5可知,在Y組中OD600 nm與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關性系數分別為ry22=0.968 2,ry24=0.930 2,ry25=0.960 6,相關性大小順序是|ry22|>|ry25|>|ry24|;TAN與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關性系數分別為ry32=0.931 7,ry34=0.879 1,ry35=0.985 4,相關性大小順序是|ry35|>|ry32|>|ry34|;pH與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關性系數分別為ry42=-0.968 6,ry44=-0.903 3,ry45=-0.921 1,相關性大小順序是|ry42|>|ry45|>|ry44|;NIT與Lactococcus、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Leuconostoc相關性系數分別為ry52=-0.952 7,ry54=-0.911 4,ry55=-0.968 5,相關性大小順序是|ry55|>|ry52|>|ry54|,在Y組中乳酸菌具有較強的降解亞硝酸能力,進一步分析乳酸菌微生物量之和與OD600 nm及理化指標的相關性。

表5 Y組各菌屬微生物量與理化指標及OD600 nm的相關性分析

由表6可知,3種乳酸菌微生物量之和與OD600 nm、TAN相關性系數分別為rs乳22=0.991 5,rs乳32=0.966 9,相關性大小順序是|rs乳22|>|rs乳32|。2種乳酸菌微生物量之和與OD600 nm、TAN、pH相關性系數分別rs乳23=0.897 3,rs乳33=0.940 9,rs乳43=-0.955 7,相關性大小順序是|rs乳43|>|rs乳33|>|rs乳23|。

表6 S組乳酸菌微生物量與OD600 nm及理化指標的相關性分析

由表7可知,3種乳酸菌微生物量之和與OD600 nm、TAN、pH、NIT相關性系數分別為ry乳22=0.993 2,ry乳32=0.976 0,ry乳42=-0.980 3,ry乳52=-0.985 0,相關性大小順序是|ry乳22|>|ry乳52|>|ry乳42|>|ry乳32|;2種乳酸菌微生物量之和與OD600 nm、TAN、pH、NIT相關性系數分別為ry乳23=0.993 2,ry乳33=0.975 8,ry乳43=-0.980 4,ry乳53=-0.984 9,相關性大小順序是|ry乳23|>|ry乳53|>|ry乳43|>|ry乳33|。

表7 Y組乳酸菌微生物量與OD600 nm及理化指標的相關性分析

3 討論

東北酸菜具有酸鮮純正、脆嫩芳香、清爽可口、增進食欲等特點,微生物群落結構的多樣性是形成其口感的原因,目前學者為研究菌屬結構對發酵蔬菜理化指標的影響,選取不同發酵時間點的發酵蔬菜進行研究[17-19]。本研究將本實驗室前期研究成果[20],結合本次實驗25 h為S組亞硝峰、15 d為最終發酵時間,因此選取1 h、13 h、25 h、73 h、15 d的酸菜勻漿作為研究對象,分析OD600 nm、理化指標及菌群結構的變化。15 d發酵結束時(見表8),S組中NIT含量為3.09 mg/L,Y組中NIT含量為11.80 mg/L,低于國家的限量標準。在菌屬結構上,uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Lactobacillus、Lactococcus和Leuconostoc是優勢菌屬,其結果與Rao等[21]的研究結果相似,乳酸菌是發酵過程中的關鍵菌屬,它可以產生有機酸,降低pH[22]。與S組相比較,Y組中TAN減少、pH值增高,該現象與張慶芳等[23]在亞硝酸鹽對Lactobacillusbrevis4903發酵中的研究結果相一致。Y組發酵體系內產酸量較低,推測原因可能為乳酸菌產生亞硝酸還原酶將NIT還原為氨氣,氨氣與乳酸菌所產乳酸反應,導致發酵環境中pH值偏高,TAN含量偏少,有利于發酵早期乳球菌屬的生長與積累。

16S rDNA測序技術檢測到的相對豐度變化不能準確地反映微生物量的動態變化,因不同樣本的微生物總量不同,高通量測序與分光光度計將活菌、死菌同時測量,所以將相對豐度與OD600 nm相結合,分析發酵過程中微生物量的變化。研究發現,發酵過程中相對豐度減少,不能說明其微生物量一定減少,甚至有可能出現增加的情況;相對豐度沒有變化,也不能說明微生物量沒有發生變化,這與Tkacz等[24]的研究結果一致。表明在利用16S rDNA測序分析菌群結構時,不能只考慮相對豐度的變化,還應關注微生物量的變化。S組和Y組菌落發酵過程中微生物量的變化說明NIT促進了Lactococcus、Leuconostoc的生長,抑制了uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Lactobacillus的生長,在前期減少了腸桿菌屬的微生物量,中、后期增加了乳酸菌菌屬的微生物量。

相關性分析發現,NIT與OD600 nm有極顯著相關性,進一步分析各菌屬與理化指標的相關性。uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae的生長與pH、NIT呈負相關,與TAN、OD600 nm呈正相關。3種乳酸菌Lactococcus、Leuconostoc和Lactobacillus均與pH、NIT呈負相關,與OD600 nm、TAN呈正相關,其中Lactococcus與NIT有顯著相關性(ry52=|-0.952 7|>r0.05),Leuconostoc與NIT有極顯著相關性(ry55=|-0.968 5|>r0.01),Lactococcus、Leuconostoc與NIT的降解具有較強的相關性。張慶芳等[25]研究發現發酵前期培養液的pH值>4.5時,乳酸菌對NIT的降解以酶降解為主;pH值<4.0后,NIT的降解主要以酸降解為主。通過比較3種乳酸菌和2種乳酸菌與OD600 nm及理化指標的相關性,研究發現在Y組中乳桿菌屬相比乳球菌屬對產酸、降解NIT能力的影響較小,其原因可能是NIT抑制了Lactobacillus的生長。亞硝酸鹽通過影響各菌屬的生長,導致TAN、pH在酸菜勻漿中發生變化,進而導致NIT與TAN、pH有極顯著相關性。

4 結論

亞硝酸鹽與總酸、OD600 nm的相關性為極顯著負相關,與pH的相關性為極顯著正相關,亞硝酸鹽的降解與Lactococcus、Leuconostoc具有較強的相關性,亞硝酸鹽促進了Lactococcus、Leuconostoc的生長,乳酸菌屬對東北酸菜發酵起到了重要作用,當達到發酵后期時,發酵體系中的亞硝酸鹽會被乳酸菌降解至安全值以下,從而消除了人們對東北酸菜中亞硝酸鹽安全性的疑慮。