左聚糖降解酶的研究進展

陳倩倩,趙紫琰,徐海洋,徐淋香

(1.江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室,江蘇 連云港 222005;2.江蘇海洋大學海洋食品與生物工程學院,江蘇 連云港 222005;3.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心,江蘇 連云港 222005;4.江蘇省海洋資源開發研究院,江蘇 連云港 222005)

天然的果聚糖(fructan)包括左聚糖(levan)和菊粉(inulin)。左聚糖來源于單子葉植物和微生物,在鴨茅等禾本科以及菊科、百合科等多種植物中作為一種儲存糖類來提供碳源和能量,但是含量較少,主要由微生物產酶催化蔗糖聚合而成[1]。左聚糖是由D-果糖構成的多糖,主鏈以β-2,6糖苷鍵連接,部分含有β-2,1連接支鏈,末端含一個葡萄糖殘基,具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性,亦有抗氧化、抗腫瘤、消炎、降膽固醇、降血糖等生物活性,被廣泛應用于食品、醫療、化妝品等領域[2-3]。

左聚糖降解酶(levan-degrading enzyme)是一類能水解β-2,6-D-果聚糖果糖苷鍵的酶。有3種類型,且同屬于糖苷水解酶32家族(glycosyl hydrolases family 32),分別為左聚糖酶(levanase)[EC3.2.1.65]、左聚糖生物水解酶(β-2,6-fructan 6-levanbiohydrolase,LF2ase)[EC3.2.1.64]、左聚糖果糖轉移酶(levan fructotransferase,LFTase)[EC4.2.2.16]。左聚糖酶將高分子量的左聚糖水解成短鏈的左聚糖型低聚果糖,左聚糖果糖轉移酶是將左聚糖催化水解,從左聚糖為底物的非還原端切下2個果糖,通過分子間脫水,形成雙果糖酐IV,而左聚糖生物水解酶將左聚糖催化生成果二糖或果糖[4]。

1 左聚糖降解酶的來源及性質

1.1 來源

左聚糖降解酶主要來源于微生物,尤其是細菌,對植物來源的左聚糖降解酶報道較少。2020年,Huang等[5]發現玉米中存在一種特異性水解左聚糖的外切水解酶,在植物生長和抵御細菌時發揮不同的調節作用。到目前為止,已經陸續發現了來自各種微生物的左聚糖降解酶,并對其進行了研究。據不完全統計,細菌的假單胞菌屬[6]、鏈霉菌屬[7-9]、固氮菌屬[10-11]、芽孢桿菌屬[12-15]、擬桿菌屬[16]、嗜熱菌[17]、微桿菌屬[18-19]、節桿菌屬[20-21],以及真菌的紅酵母屬[22]皆是左聚糖降解酶的來源,其中對芽孢桿菌屬的左聚糖降解酶研究較多。

1.2 性質

3種左聚糖降解酶的主要酶學性質見表1。左聚糖降解酶的最適溫度一般為30～50 ℃,在50 ℃以下較穩定。但源于Rhodotorulasp.的左聚糖酶在4 ℃時具有78%的最大活性且相當穩定,而在25 ℃和40 ℃時,殘余活性分別只有43%和35%,在70 ℃時完全失活,則該左聚糖酶屬于低溫酶。大多數左聚糖降解酶的最適pH為酸性,在5.0～6.5之間,僅少數左聚糖降解酶的最適pH為中性。來源于Pseudomonassp. No.43和Streptomycessp. 366L的外切左聚糖酶的最適pH為7.0,來源于Microbacteriumsp. AL-210的左聚糖果糖轉移酶的最適pH也為中性,且這3種不同來源的酶均在堿性條件下保持穩定,Microbacteriumsp. AL-210的左聚糖果糖轉移酶和Pseudomonassp. No.43的外切左聚糖酶在pH 7.0～8.0范圍內保持穩定,Streptomycessp. 366L的外切左聚糖酶在pH 7.0～10.0范圍內保持穩定。不同來源或不同類型的左聚糖降解酶,不但能降解左聚糖,而且能降解含有β-2,1-糖苷鍵的菊粉、蔗糖、棉子糖等。例如:源于Gluconacetobacterdiazotrophicus的外切左聚糖酶不僅水解左聚糖,而且水解蔗糖、菊粉和棉子糖;Thermophilic bacteria的左聚糖酶水解左聚糖、蔗糖和麥芽糖;Rhodotorulasp.的左聚糖酶能水解左聚糖、蔗糖和菊粉;Bacillussp.No.71的內切左聚糖酶水解左聚糖和梯牧草糖;MicrobacteriumlaevaniformansATCC 15953的左聚糖生物水解酶能催化水解左聚糖、菊粉、蔗果三糖和蔗果四糖;StreptomycesexfoliatusF3-2的左聚糖生物水解酶能水解左聚糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖;ArthrobacterureafaciensK2032的左聚糖果糖轉移酶能催化左聚糖、蔗果三糖和蔗果四糖。

表1 左聚糖降解酶酶學性質

2 左聚糖降解酶的結構

已報道的左聚糖降解酶(levanase、LF2ase和LFTase)均屬于糖苷水解酶32家族。此家族有共同的三維結構特征:由N-端5-折疊β-螺旋漿形成的催化結構域和C-端β-折疊片形成的非催化結構域組成,N-端每個螺旋漿包括4個反向平行的β-折疊片,形成經典的‘W’拓撲結構,輻射狀圍繞著中心軸,封閉帶負電荷的催化活性口袋。每個β-折疊片之間由發卡環連接,每個螺旋漿的β-折疊片1離中心軸最近,并與中心軸平行。整個N-端結構域的形狀類似圓柱形,每個螺旋漿β-折疊片4位于圓柱筒的最外面。C-端非催化結構域由2個反向平行的β-折疊片組成,每個β-折疊片包括6股β-折疊線,組裝成類似三明治的結構[23],見圖1。

圖1 左聚糖降解酶的三維結構

3 左聚糖降解酶的應用

3.1 左聚糖果糖轉移酶在生產雙果糖酐IV中的應用

雙果糖酐(DFAs)是一種天然的功能性食品添加劑,由于其甜度遠低于蔗糖,并且結構穩定,在高溫和極端pH下也能保持穩定,對于糖尿病患者來說,雙果糖酐是一種極好的甜味劑[24]。雙果糖酐IV是雙果糖酐的一種,由左聚糖果糖轉移酶催化水解左聚糖生成,雙果糖酐IV和雙果糖酐Ⅲ具有相同的生理功能,都是不能被腸道消化吸收的寡糖,這些糖被腸道微生物利用,轉化為有機酸(乙酸、丁酸和乳酸),從而降低盲腸內的pH值,增強鈣的溶解度,達到增強腸道對鈣的吸收的目的[25-26]。利用左聚糖果糖轉移酶來生產雙果糖酐IV是最理想可行的方法。2000年,Song等[21]在土壤中分離到能夠產左聚糖果糖轉移酶的微生物——ArthrobacterureafaciensK2032,利用酶法生產雙果糖酐IV、低聚果糖和果糖,其轉化率約為62.5%。Cha等[19]在土壤樣品中發現了Microbacteriumsp. AL-210,此細菌可產生左聚糖果糖轉移酶,并且雙果糖酐IV是該左聚糖果糖轉移酶的主要產物,轉化率約為44%。Kikuchi等[27]以蔗糖為原料,利用SerratialevanicumNN來生產左聚糖,使ArthrobacternicotinovoransGS-9在大腸桿菌中高度表達,通過ArthrobacternicotinovoransGS-9的左聚糖果糖轉移酶將左聚糖一罐轉化制備成雙果糖酐IV,由于面包酵母不能發酵雙果糖酐IV,因此使用酵母發酵來去除雙果糖酐IV以外的所有糖,雙果糖酐IV的產率高達90.7%,這種不需要分離左聚糖的一罐轉化制備方法的優勢亦被證實。

3.2 左聚糖酶及左聚糖生物水解酶在低聚果糖生產中的應用

低聚果糖可作為益生元來調節人體腸道微生物菌群的組成,改善腸道環境,從而維持身體健康和治療疾病,在食品領域具有巨大的市場潛力[28]。由于缺乏可用的植物來源的左聚糖,Porras-Domínguez等[13]首先以蔗糖為原料,利用來源于Bacillussubtilis的左聚糖蔗糖酶生成左聚糖,其次,用Bacilluslicheniformis的內切左聚糖酶水解左聚糖,即可得到左聚糖型低聚果糖,缺點是廣泛的水解會使果二糖成為主要產物。為了能夠一體化、大量生產左聚糖型低聚果糖,研究者采用一種基于左聚糖蔗糖酶和內切左聚糖酶同時作用的方法高效生產左聚糖型低聚果糖。H?evels等[11]將來源于AzotobacterchroococcumDSM 2286的左聚糖酶基因與GluconobacterjaponicusLMG 1417的左聚糖蔗糖酶基因在大腸桿菌內共表達,大腸桿菌粗提取物利用蔗糖進一步合成左聚糖型低聚果糖。該方法不但成本低,而且效率高,已成功應用于左聚糖型低聚果糖的生產。Rahman等[29]利用一種無載體固定化技術提高了左聚糖酶的穩定性,為左聚糖型低聚果糖的生產奠定了基礎。在制備交聯左聚糖酶聚集體的過程中加入牛血清白蛋白交聯劑比加入戊二醛交聯劑得到的固定化酶活力回收率高,從而獲得的左聚糖型低聚果糖也較高。因此,所制備的牛血清白蛋白交聯左聚糖酶聚合物偶聯體可以用于生產低聚果糖,以滿足各個領域的市場需求。果二糖也是一種左聚糖型低聚果糖。Saito等[20]發現StreptomycesexfoliatusF3-2可以產生一種外切酶,研究發現該外切酶不僅能水解β-2,6-糖苷鍵,而且能水解β-2,1-糖苷鍵,主要水解產物為果二糖。經鑒定,該酶是一種能生產果二糖的左聚糖生物水解酶。Song等[18]將MicrobacteriumlaevaniformansATCC 15953左聚糖生物水解酶基因克隆,并在大腸桿菌內表達,經純化,該重組酶的主要產物為果二糖。因此,利用水解酶來生產低聚果糖有巨大的發展潛力。

4 展望

左聚糖降解酶的發現在食品領域具有里程碑的意義。近年來,對于左聚糖降解酶的應用研究主要集中在低聚果糖的生產方面,對雙果糖酐IV和果二糖的報道較少。左聚糖型低聚果糖的一些生物學功能可以滿足工業需求及市場需求,但是實現大規模生產并非易事。不同來源的左聚糖降解酶的活性差異大,且分離純化困難,大大限制了左聚糖降解酶在工業中的應用,酶分子生物學改造技術能提高酶活力和穩定性,有望解決左聚糖降解酶在工業生產中的問題。因此,對左聚糖降解酶進行深入研究,使其滿足工業生產條件,仍是研究的熱點。