丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物基于TGF-β1抑制人皮膚成纖維細胞的研究

辛林林 王浩南 張喆 白艷紅 劉紅燕 周穎 李慶軍 劉謙 張永清

[摘要]目的：研究丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對轉化生長因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導人皮膚成纖維細胞（Human skin fibroblasts，HSF）抑制瘢痕形成的影響及分子機制。方法：配制丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物（丹參酮ⅡA與隱丹參酮標準品按照1∶1的比例配置）溶液，采用TGF-β1誘導HSF細胞增殖構建增生性瘢痕體外細胞模型；采用MTT法測定丹參酮ⅡA與隱丹參酮對HSF細胞增殖的影響；采用Western Blot法檢測HSF細胞中TGF-β1/Smad信號通路下游信號分子p-Smad2、Smad3蛋白以及Survivin蛋白表達水平變化。結果：丹參酮ⅡA與隱丹參酮能劑量依賴地抑制HSF細胞的增殖，降低p-Smad2、Smad3蛋白和Survivin蛋白表達水平。結論：丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物可能通過下調p-Smad2、3和Survivin蛋白的水平，抑制HSF細胞的增殖，發揮抑制瘢痕的作用。

[關鍵詞]丹參酮ⅡA；隱丹參酮；人皮膚成纖維細胞；轉化生長因子-β1；瘢痕

[中圖分類號]R285? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）09-0054-04

Inhibition of Tanshinone ⅡA and Cryptotanshinone? Mixture on Human Skin Fibroblasts Based on TGF-β1

XIN Linlin，WANG Haonan，ZHANG Zhe，BAI Yanhong，LIU Hongyan，ZHOU Ying，LI Qingjun，LIU Qian，ZHANG Yongqing

（College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，Shandong，China）

Abstract： Objective? To explore the effect and mechanism of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone mixture on the proliferation of fibroblasts stimulated by transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， and to provide a theoretical basis for further development and utilization of Danshen. Methods? Tanshinone ⅡA and cryptotanshinone mixture （Tanshinone ⅡA and cryptotanshinone were mixed at a ratio of 1∶1） was prepared to treat human skin fibroblasts （HSF） cells which was stimulated by TGF-β1. The effect of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone on the proliferation of HSF cells was determined using MTT method. The expression levels of protein p-Smad2， 3 and Survivin， downstream signals of TGF-β1/Smad pathway， were determined by western blot （WB）. Results? The results showed that tanshinone ⅡA and cryptotanshinone could inhibit the proliferation of HSF cells and suppress the expression levels of p-Smad2， 3 and Survivin in a dose-dependent manner. Conclusion? Tanshinone ⅡA and cryptotanshinone mixture could inhibit the proliferation of HSF cells by significantly reducing the phosphorylation of Smad2 and 3， and down-regulating the expression level of Survivin.

Key words： tanshinone ⅡA; cryptotanshinone; human skin fibroblast; transforming growth factor-β1; scar

丹參為唇形科植物丹參的干燥根與根莖[1]，始載于《神農本草經》，具有活血化瘀、清心除煩、通經止痛、涼血消癰等功效。藥理研究證明，丹參對心、肝、肺、腎等臟器具有顯著的抗纖維化作用[2-4]，一般認為是通過抑制HSF增殖與膠原纖維累積而實現的。本課題組前期對民間驗方丹參膏進行工藝優化制成滅瘢膏，并對滅瘢膏進行成分和藥效研究，結果顯示，丹參酮ⅡA與隱丹參酮是滅瘢膏發揮抗皮膚組織纖維化的主要有效成分，含量分別為2.11 mg/g與2.20 mg/g且比例接近1∶1。為進一步提高滅瘢膏的制劑工藝水平和臨床療效，本研究繼續通過TGF-β1誘導HSF細胞，從細胞和分子層面研究丹參酮ⅡA與隱丹參酮抑制瘢痕形成的機制。

1? 材料和方法

1.1 細胞來源：人皮膚成纖維細胞（HFF-1，167921）購自中國科學院干細胞庫，培養擴增，取第3～8代細胞用于實驗。

1.2 藥物和試劑：羊脂（20200616，泰安明睿有限公司），丹參酮ⅡA標準品（Y16M10C88487，上海源葉生物科技有限公司），隱丹參酮標準品（C28M6Y1，上海源葉生物科技有限公司）；HFF-1特殊培養基（167921，中國科學院干細胞庫）；胎牛血清（10270-106，Gibco）；p-Smad2抗體（#18338，Cell Signaling Technolog）、p-Smad 3抗體（#9520，Cell Signaling Technolog）；Survivin蛋白抗體（ab134170，Abcam），GAPDH抗體（ab179695，Abcam）；BCA總蛋白測定試劑盒（20201218，南京建成工程生物工程研究所）。

1.3 儀器：XD-101 CO2細胞培養箱（Sanyo）；IX 71生物倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus）；muLISKANMK3酶標儀（Thermo）；EPS300垂直電泳槽，Tanon 4 600全自動化學發光分析儀（Tanon）。

1.4 方法

1.4.1 HSF細胞培養條件與藥品配置

1.4.1.1 細胞培養條件：HSF細胞用HFF-1特殊培養基于37℃、5% CO2、95% 相對飽和濕度環境下靜置培養至第3～8代，取生長狀態良好的對數期細胞進行試驗。

1.4.1.2 丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液配置：精密稱取丹參酮ⅡA與隱丹參酮，按照1μmol/L丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液=1μmol丹參酮ⅡA+1 μmol隱丹參酮配制；為保證二甲基亞砜（DMSO）最終濃度為0.5%，以配置最高濃度64 mol/L的丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液為例，先配置10 ml濃度為12.8 mmol/L的丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液，原溶液經2倍稀釋混勻成各濃度待用，給藥處理時取10μl原溶液與90μl培養基混合成混合液，取混合液10μl加入至細胞培養孔中（190μl）即可。

1.4.2 丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對TGF-β1干預下HSF細胞增殖數的測定：采用MTT法，以每孔4×104/100μl的密度接種至96孔細胞培養板中孵育過夜后，將細胞分為blank組（0μmol/L丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液），TGF-β1組（0μmol/L丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液），丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物給藥組（1、2、4、8、16、32μmol/L丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物溶液）。TGF-β1組、丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物給藥組用5 ng/ml的TGF-β1干預處理2 h后全部分別按上述濃度給藥處理；孵育0 h和48 h時取出培養板，將稀釋在HFF-1特殊培養基中的MTT溶液加入孔中培養4 h后，移至酶標板中檢測各組595 nm處吸光度（A）值。

1.4.3 丹參酮ⅡA和隱丹參酮對HSF細胞增殖數的測定：采用MTT法，以每孔4×104/100μl的密度接種至96孔細胞培養板中孵育過夜后，將細胞分為blank組（0μmol/L），丹參酮ⅡA組（2、4、8、16、32、64μmol/L丹參酮ⅡA），隱丹參酮組（2、4、8、16、32、64μmol/L隱丹參酮），丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物給藥組（1、2、4、8、16、32μmol/L丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物）全部分組按上述濃度給藥處理；孵育0 h和48 h時取出培養板，將稀釋在HFF-1特殊培養基中的MTT溶液加入孔中培養4 h后，移至酶標板中檢測各組595 nm處吸光度（A）值。

1.4.4 丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對TGF-β1干預下HSF細胞中p-Smad2/3，Survivin蛋白表達水平檢測：取細胞樣本于離心管中加150μl裂解液超聲1 min后于冰上裂解30 min，裂解完畢后于4 ℃下12 000 r/min離心15 min后吸取上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度；內參蛋白為GAPDH，在10%SDS-PAGE凝膠電泳中進行蛋白質分離，轉到PVDF膜上，室溫孵育1 h后4℃與下列抗體孵育過夜：p-Smad2（1∶1 000），p-Smad3（1∶1 000），Survivin（1∶300），GAPDH（1∶5 000），洗膜3次后加過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG作為二抗，室溫孵育40 min后洗膜3次，加免疫增強化學發光（ECL）劑反應2 min后觀察拍照。

1.5 統計學分析：用Image J軟件對WB條帶進行灰度分析，SPSS 23.0軟件對實驗數據進行統計分析，數據結果以（xˉ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2? 結果

2.1 丹參酮ⅡA和隱丹參酮對HSF細胞增殖的影響：在48 h內，丹參酮ⅡA和隱丹參酮對HSF細胞增殖均起抑制作用，并呈劑量依賴性，濃度越高抑制作用越強，丹參酮ⅡA與隱丹參酮的IC50分別為：39.715 μmol/L、57.024μmol/L。見圖1。在干預48 h后，丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對HSF細胞起到抑制作用，IC50為29.705μmol/L，在不添加TGF-β1誘導的條件下，丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對HSF的抑制作用呈劑量依賴性，濃度越高抑制作用越強。見圖2。

2.2 丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對TGF-β1誘導下HSF細胞增殖的影響：與blank組比較，TGF-β1干預可顯著促進HSF細胞增殖（P＜0.01）。丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對TGF-β1誘導下的HSF細胞抑制率隨其濃度增加而升高，48 h時丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對TGF-β1誘導下HSF細胞IC50為41.949μmol/L。見圖3。

2.3 丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對TGF-β1誘導下HSF細胞中Smad2/3蛋白磷酸化和Survivin蛋白表達的影響：與blank組比較，TGF-β1干預可顯著促進HSF細胞的Smad2、3蛋白磷酸化水平與Survivin蛋白表達水平（P＜0.01），而丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物干預可明顯抑制TGF-β1/Smad通路中Smad2/3蛋白磷酸化水平及Survivin蛋白表達水平，且抑制效果呈現劑量依賴。結果可表明丹參酮ⅡA與隱丹參酮可能通過抑制TGF-β1/Smad通路中Smad2/3磷酸化，下調Survivin蛋白表達水平，促進HSF細胞凋亡，進而抑制瘢痕形成。見圖4。

3? 討論

增生性瘢痕是一種纖維代謝性疾病，隨著細胞、分子生物學的不斷研究，發現細胞增生和凋亡失衡或許是增生性瘢痕形成的重要病理學基礎[5-6]。現代醫學研究認為其細胞凋亡不足、促凋亡基因或凋亡抑制基因表達紊亂都會導致瘢痕的產生[7]。HSF細胞參與皮膚創面愈合與瘢痕形成的全過程，研究發現，HSF細胞凋亡不足可能是導致增生性瘢痕產生的重要原因[8-9]。

中藥或中藥提取物能有效抑制瘢痕組織的形成并減少肌膚紅腫或過敏等副作用[10]。丹參作為常用大宗藥材之一，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、改善微循環和調節免疫等多種藥理作用，是治療增生性瘢痕的潛在藥物[11-12]。研究表明，丹參酮ⅡA可以誘導腫瘤細胞凋亡，其機制可能與抑制Survivin蛋白表達有關[13]。Zhan CY等[14]研究發現丹參酮ⅡA可以抑制TGF-β1誘導的大鼠心臟HSF中Smad2/3磷酸化，阻斷TGF-β1/Smad信號通路的表達，降低心肌纖維化。楊莉等[15]研究發現，隱丹參酮可以抑制兔耳增生性瘢痕產生，其機制可能與TGF-β1/Smad信號通路有關，但尚未涉及隱丹參酮對HSF細胞的干預功能及其作用機制。本實驗以培養HSF細胞為研究對象，通過MTT實驗評價隱丹參酮與丹參酮ⅡA與對細胞活性的影響。結果顯示，與空白對照組相比，兩種丹參酮對HSF細胞增殖活性均起到一定的抑制作用，濃度越高抑制作用越強。經計算，在48 h內，隱丹參酮、丹參酮ⅡA和丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物對HSF細胞的IC50分別為57.024、39.715 和29.705μmol/L，丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物與單純使用隱丹參酮、丹參酮ⅡA的IC50分別降低了47.91%與25.20%，提示相同作用時間下，丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物能顯著抑制HSF細胞的增殖，減少瘢痕產生。

TGF-β1是與增生性瘢痕形成關系最密切的因子，能調控細胞生長分化，調節膠原蛋白積累，維持纖維化平衡[16]。大量研究表明，TGF-β1通過激活Smad介導的TGF-β1/Smad信號通路參與膠原纖維代謝的調控，對傷口愈合和瘢痕形成的發生和發展起到重要作用[17]。Survivin蛋白是目前已知最強凋亡蛋白抑制因子，與Caspase家族相互作用后，可以抑制HSF細胞凋亡，造成HSF細胞大量繁殖和膠原過度沉積[18]。已有研究證明，敲低Survivin蛋白的前列腺癌細胞中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad4表達水平明顯降低，Survivin蛋白過表達則可以增加TGF-β1、Smad4表達，促進Smad2/3磷酸化[19]。同樣在銀屑病皮損組織中發現TGF-β1可以激活Survivin蛋白的表達，通過TGF-β1/Survivin途徑干擾細胞增殖和凋亡[20]。本研究探討了丹參酮ⅡA與隱丹參酮對TGF-β1/Smad信號通路中p-Smad2/3、Survivin蛋白表達。Western Blot結果顯示，HSF細胞在TGF-β1誘導下，細胞增殖活性顯著增強，其Survivin蛋白以及p-Smad2/3水平顯著上升，在丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物進行處理后，細胞增殖活性降低，Survivin、p-Smad2/3水平降低。

綜上所述，丹參酮ⅡA與隱丹參酮對HSF細胞增殖起到抑制作用，可以減少增生性瘢痕的產生，為進一步開發丹參用于外傷治療提供借鑒參考。

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[收稿日期]2022-07-13

本文引用格式：辛林林，王浩南，張喆，等.丹參酮ⅡA與隱丹參酮混合物基于TGF-β1抑制人皮膚成纖維細胞的研究[J].中國美容醫學，2023，32（9）：54-57.