31份小麥材料中抗旱基因的KASP檢測

李 瑋,孔淑鑫,宋國琦,李玉蓮,張淑娟,張榮志,高 潔,李吉虎,樊慶琦,李根英

(1.山東省農業科學院作物研究所/小麥玉米國家工程研究中心/農業農村部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/山東省小麥技術創新中心,山東濟南 250100; 2.山東農業工程學院農業科技學院,山東德州 251100)

干旱是影響小麥產量的重要因素之一。選育抗旱節水品種是保障旱地小麥穩產最經濟、有效的方法。傳統小麥抗旱育種是在種質創新的基礎上,通過雜交后代的抗旱鑒定和產量篩選培育抗旱品種,通常采用高產×抗旱或抗旱×抗旱的組合模式,目前仍是品種選育的主流方法。但傳統小麥抗旱育種方法周期較長、育種效率低,因此縮短育種年限、加快育種進程已成為目前小麥新品種選育的客觀要求。

隨著小麥基因組的測序完成,越來越多與小麥抗旱相關的基因被定位和克隆,為小麥抗旱分子標記育種奠定了基礎。鞠麗萍等[1]根據不同抗旱性小麥品種中鐵結合蛋白基因(TaFer-A1)的序列差異開發了分子標記FerA1-intrl,并進行了有效性驗證,發現該標記FerA1-intr1可用于小麥抗旱性的鑒定和篩選,也表明TaFer-A1基因與小麥抗旱性有關。Shoaib等[2]利用16個小麥抗旱基因的KASP標記對153份小麥品種進行了檢測,發現優異等位基因與產量性狀顯著相關。于銘等[3]通過分析吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(TaP5CS)在不同抗旱性小麥品種中的序列差異,發現第5內含子上存在SNP,據此開發了分子標記TaP5CS-1A-CAPS,可用于小麥萌發期抗旱性的篩選與鑒定。Mao等[4]研究發現,TaPYL1-1B基因啟動子區的20 bp插入與抗旱性顯著關聯,20 bp的插入中含有的MYB元件可以增強TaPYL1-1B的表達,從而提高小麥的抗旱性。以上研究均為小麥抗旱品種選育提供了有效標記。隨著大量與抗旱相關分子標記的開發與應用,分子標記在抗旱小麥品種輔助選育過程中已成為重要的篩選方法。

為提高抗旱小麥育種過程中親本材料選擇的目的性和準確性,本研究利用29個KASP標記,對收集到的16份抗旱小麥品種和15份高產小麥品種進行檢測,明確這些材料中抗旱基因的分布情況,以期為分子標記輔助選擇創制聚合優異基因的新種質提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥品種共31份,其中抗旱小麥品種16份,包括濟麥379、山農27、和尚頭、青麥6號、臨麥9號、濟麥262、濟麥60、存麥1號、晉麥47、晉麥92、晉麥101、青麥7號、魯麥21、品育8161、鶴麥801和洛旱7號;高產小麥品種15份,包括MFW1、魯研128、周麥27、山農20、煙農19、煙農999、中麥578、濟麥5198、濟麥38、山農30、濟麥22、山農29、百農207、魯原502和矮抗58,均由本課題組收集保存。

1.2 DNA提取和分子標記檢測

取5粒均勻飽滿的小麥種子置于一次性培養皿中,加水浸泡24 h左右,待種子露白后選擇生長一致的3粒種子種植在裝有育苗基質的塑料盆中,在人工氣候室(23 ℃光照/18 ℃黑暗,16 h光照/18 h黑暗)繼續培養7 d后,每株取3個葉片,按照高 潔等[5]的方法提取DNA。

1.3 分子標記類型轉換及KASP檢測

利用已報道的29個標記[2-4,6-12](表1)對供試材料進行檢測,其中18個標記類型為KASP,所用引物序列參考相應文獻。對其他11個標記進行KASP轉換,利用文獻中報道的原始標記引物序列,通過WheatOmics[13]網站進行序列比對,獲得參考基因組的分子標記擴增序列,按照文獻描述的SNP或Indel信息修改參考基因組序列,獲得等位變異序列。用DNAMAN對2個序列進行比對,設計KASP標記引物。

表1 已報道的29個標記的類型Table 1 Types of 29 markers reported

進一步對KASP標記引物進行檢測,選取分型效果好的引物組合進行檢測。試驗所需的KSAP標記引物均由北京擎科生物科技有限公司合成,共有三組混合引物,每一組混合引物都含有兩條末端堿基不同的等位基因正向引物(100 μmol·L-1)各12 μL、一條共同的反向引物(100 μmol·L-1)30 μL以及ddH2O 46 μL。PCR反應體系為5 μL,包括2.0 μL DNA ( 50 ng·μL-1),2.5 μL KASP Master Mix ( LGC Genomics, Hoddeston, UK),0.07 μL混合引物和0.43 μL ddH2O。為避免對試驗結果的誤判,設置空白對照,其DNA模板用ddH2O代替。PCR反應在ABI veriti PCR儀上進行,PCR反應程序:95 ℃預變性15 min;95 ℃變性20 s,65 ℃退火和延伸25 s,10個循環;57 ℃退火和延伸60 s,30個循環。反應結束后利用PHERA star多功能酶標儀讀取熒光數據﹐通過Kluster Caller軟件(LGC Genomics, Hoddeston, UK)生成基因分型圖。

2 結果與分析

2.1 分子標記類型的轉換結果

由于部分基因(表2第1列)的原始標記為STS或CAPS,為了提高檢測效率,需將其轉化成KASP標記。利用中國春參考基因組通過引物的序列比對,獲得引物的物理位置以及11個分子標記擴增產物的原始參考基因組序列,根據SNP或Indel位點設計11對KASP引物,并對31份小麥品種的DNA進行檢測,表明這些STS或CAPS標記已成功轉化為KASP標記(表2)。其中,TaSRL1-4A基因的2個SNP轉化為2個KASP標記。

2.2 KASP標記檢測結果

利用29個KASP標記對31份小麥品種進行檢測,部分標記的檢測結果如圖1所示。根據31份小麥品種的檢測結果,可將KASP標記分成四類,第一類是優異等位基因占比較高的標記(圖2),包括DRO5A(90.32%)、TaDreb_SNP(77.42%)、TaPPH-KASP-13(83.87%)、PYL1B(83.87%)、VSR1-2BMITE(87.10%)、1fehw3(74.19%)、SnRK2.4B3(90.32%)、TaSnRK2.8-5A-KASP-7(93.55%)、TaLTPs-KASP-11+TaLTPs-KASP-12(87.10%)和Wcor142B(77.42%),表明這些標記檢測到的優異等位基因在供試材料中利用程度較高;第二類是兩種等位基因占比相當的標記,包括P5CS1A(54.84%)、SRL14A929(54.84%)、SRL14A96(54.84%)和TaSnRK2.3-1A-KASP-2(41.94%),表明這些標記檢測到的優異等位基因在供試材料中利用程度中等;第三類是優異等位基因占比較低的標記,包括WRKY51-2B(9.68%)、WRKY51-2A(32.26%)、TaSnRK2.3-1B-KASP-4(22.58%)、SnRK2.4A3(3.23%)、TaSnRK2.9-5A-KASP-5(23.33%)、TaSnRK2.9-5A-KASP-6(23.33%)、COBL5B(22.58%)、AX109558906-6B(29.03%)和OSCA1.4(12.90%),表明這些標記檢測到的優異等位基因在供試材料中利用程度較低;第四類是在所檢測材料中只檢測到一種等位基因的標記,包括TaSAP-7B-KASP-8、AX-95025477-7B、TaMoc-2433、DRO5B和TaPARG-2A-KASP-9,其中AX-95025477-7B和TaMoc-2433檢測到的基因為非優異等位基因,其余為優異等位基因的功能標記。

a:WRKY51-2A;b:TaDreb_SNP;c:AX-95025477-7B,d:P5CS1A。紅色點為Hex等位基因;藍色點為Fam等位基因;綠色點為雜合型;黑色點為陰性對照。a: WRKY51-2A; b: TaDreb_SNP; c: AX-95025477-7B; d: P5CS1A. Red dots represent Hex allele; Blue dots represent Fam allele; Green dots represent heterozygous; Black dots represent no template control.圖1 供試材料中部分KASP標記檢測分型圖(散點圖)Fig.1 Detection of the tested wheat materials by KASP markers(scatter plots)

圖中白色、淺灰色、黑色和深灰色柱子分別代表Fam等位基因、Hex等位基因、雜合基因型和未知基因型。The white, light gray, black and dark gray bars represent Fam, Hex, heterozygous and unknown allele, respectively.圖2 29個KASP標記所檢測到的等位基因分布頻率Fig.2 Allele frequency detected by 29 KASP markers

2.3 雙標記對抗旱相關基因的檢測結果

分別用2個KASP標記對3個抗旱基因TaLTPs、TaSRL1-4A和TaSnRK2.9-5A進行檢測,TaLTPs基因的2個標記TaLTPs-KASP-11和TaLTPs-KASP-12是根據TaLTPs啟動子區的2個SNP開發而來,2個SNP共形成3種單倍型[14],本研究中共檢測到HapⅡ和HapⅢ兩種單倍型,其中HapⅢ是主要單倍型,與株高相關。TaSRL1-4A基因雖然在啟動子和編碼區共有3個SNP[9],但僅有2種單倍型Hap-4A-1和Hap-4A-2,2個標記SRL14A929和SRL14A96的檢測結果完全一致,2種單倍型各占50%左右,Hap-4A-2單倍型與高千粒重相關。TaSnRK2.9-5A基因的2個標記TaSnRK2.9-5A-KASP-5和TaSnRK2.9-5A-KASP-6形成4種單倍型[15],本研究共檢測到Hap-5A-1、Hap-5A-3和Hap-5A-4三種單倍型,2個標記的檢測結果完全一致。其中Hap-5A-1與高千粒重相關,Hap-5A-4與高穗粒數相關,分別占比23.33%和3.23%。

2.4 高產小麥品種和抗旱小麥品種之間優異等位基因的數目差異

將供試小麥品種分成高產組和抗旱組分別進行統計,發現大部分標記所檢測到的優異等位基因數目在組間差異較小(小于等于3),差異優異等位基因數目超過3個的標記包括PYL1B、Wcor142B、SRL14A96、SRL14A929、TaSnRK2.3-1A-KASP-2和AX109558906-6B(圖3),其中僅Wcor142B在高產組中檢測到的優異等位基因數目比抗旱組多,其余均是抗旱組較多,表明這些標記在抗旱育種中值得關注。此外,WRKY51-2B和SnRK2.4A3標記所檢測到的優異等位基因數目雖然在組間差異較小,但僅在抗旱組中能檢測到優異等位基因。攜帶TaWRKY51-2B位點優異等位基因 Hap-2B-Ⅱ(與根長相關[6])的品種有晉麥47、晉麥92和晉麥101,攜帶TaSnRK2.4-3A位點優異等位基因T allele(與高千粒重相關[16])的品種僅有濟麥379。

黑色和白色分別代表抗旱小麥品種和高產小麥品種。Black and white represent drought resistant wheat cultivars and high-yield wheat cultivars, respectively.圖3 抗旱小麥品種和高產小麥品種優異等位基因數目差異比較Fig.3 Comparison of allele number between drought resistant wheat cultivars and high-yield wheat cultivars

3 討論

抗旱育種在我國開展較早,通過常規育種方法已選育出大量抗旱節水小麥品種。進入21世紀以來,抗旱小麥新品種選育進展緩慢,新審定的旱地品種雖然在產量和品質上有所提高,但在生產上抗旱性的表現并不佳。隨著現代生物技術的發展,越來越多的功能基因或QTL被挖掘,為分子標記輔助選擇抗旱育種奠定了基礎[17-18]。明確親本的等位基因組成,根據基因互補原則,選擇抗旱基因供體親本和高產受體親本進行雜交組配,結合農藝性狀選擇和分子標記輔助選擇的方法可提高育種效率。本研究利用29個KASP標記對收集的16個抗旱小麥品種和15個高產小麥品種進行了分子檢測,通過對比發現,Wcor142B標記在高產小麥品種中檢測到的優異等位基因占比較高,而PYL1B、SRL14A96、SRL14A929、TaSnRK2.3-1A-KASP-2、AX109558906-6B標記在抗旱小麥品種中檢測到的優異等位基因占比較高。Mao等[4]研究發現,TaPYL1-1B位點的優異等位基因與小麥的高ABA(脫落酸)敏感性、高光合能力和高水分利用效率相關。Zhuang等[9]研究發現,TaSRL1-4A位點的優異等位基因Hap-4A-2與淺根、矮稈和高千粒重相關。Miao等[19]研究發現,TaSnRK2.3-1A位點的優異等位基因Hap-1A-1與矮稈和高千粒重相關。Yang等[8]研究發現,QTDW.caas-6BL、QRDW.caas-6BL和QSDW.caas-6BL位點的優異等位基因與較高的根干重、根表面積和地上部干重相關。本研究中TaPYL1-1B、TaSRL1-4A、TaSnRK2.3-1A以及QTDW.caas-6BL/QRDW.caas-6BL/QSDW.caas-6BL的優異等位基因占比分別為83.87%、45.16%、41.94%和29.03%。說明上述位點的優異等位基因在育種中已得到利用,但是利用率還有待提升。本研究僅在抗旱品種中檢測到優異等位基因TaWRKY51-2B和TaSnRK2.4-3A,并篩選到TaWRKY51-2B的供體親本為晉麥47、晉麥92、晉麥101,TaSnRK2.4-3A的供體親本為濟麥379。濟麥379是新審定的節水多抗優質早熟小麥新品種,攜帶TaSnRK2.4-3A位點優異等位基因;攜帶TaWRKY51-2B位點的優異等位基因的三個品種中,晉麥101與濟麥379的優異等位基因互補性更好。因此,開展以晉麥101為優異等位基因供體,以濟麥379為受體的遺傳改良工作,在保持濟麥379優異性狀的基礎上利用分子育種技術進一步聚合抗旱和高產優異等位基因,有望培育出更好的抗旱品種。