冬小麥miR172響應抗寒的特征分析

王多佳,王政委,任志鵬,彭瞰看,田 宇,張 達,徐慶華,蒼 晶

(東北農業大學生命科學學院,黑龍江哈爾濱 150030)

低溫是影響小麥生長發育、分布及產量的重要因素之一。東農冬麥1號(Dn1)是我國首個能在黑龍江省高寒地區安全越冬(返青率>85%)的強抗寒性(可耐-30 ℃低溫)冬小麥品種[1],研究其響應低溫脅迫的分子機制,對選育耐寒性小麥品種具有重要的理論意義。

miRNA(microRNA)是一類來自真核生物自身基因組的非編碼小分子RNA,長度一般為21～25 nt,在轉錄后調控基因表達,對植物的生長發育、非生物脅迫應答等過程均發揮重要作用[2]。miRNA家族中,miR172是最早被發現同時也是被研究最透徹的成員之一[3],其靶基因主要編碼AP2/ERF (APETALA2/ethylene responsive factor)類轉錄因子。AP2/ERF轉錄因子為植物所特有,幾乎參與植物生長發育的各個環節[4]。研究發現,miR172/AP2模塊不僅參與植物生長發育過程(包括花器官發育、塊莖、根瘤形成等[5-7]),也參與植物衰老以及響應逆境等過程[8]。在小麥中,miR172不僅可通過控制馴化基因Q的表達調控穗型發育[9];也可負調控其靶基因AP2的表達,參與小麥滲透脅迫響應[10]。但有關miR172介導作物響應低溫脅迫機制的研究鮮有報道。

Dn1作為強抗寒性冬小麥品種,含有大量與抗寒相關的miRNA。本課題組前期利用構建的不同溫度(5 ℃、-10 ℃、-25 ℃)下 miRNA高通量測序數據庫,獲得了顯著差異表達的miR172,本研究對其靶基因進行預測,并采用生物信息學、qRT-PCR、瞬時表達等技術分析Dn1中miR172/AP2模塊調控小麥抗寒機制,以期為培育強抗寒性冬小麥品種提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

冬小麥品種為東農冬麥1號(Dn1),由東北農業大學小麥育種實驗室提供。煙草品種為本氏煙,由東北農業大學植物生理與分子生物學研究室提供。大腸桿菌DH5α、農桿菌EHA105和植物表達載體 PBI121-GUS等由本課題組保存。

1.2 大田取樣

將Dn1種子于2018年9月8日播種于東北農業大學試驗地,種植方法參考田 宇等[11]的報道。待麥苗長至三葉期,大田自然降溫連續10 d平均最低溫度為5 ℃(對照溫度,2018年10月15日)、0 ℃(2018年11月02日)、-10 ℃(2018年11月23日)和-25 ℃(2019年1月14日)時,選取長勢一致的麥苗,剪取分蘗節,置于-80 ℃保存,備用。

1.3 Dn1中tae-miR172的前體pre-tae-miR172及其靶基因Ap2的克隆與生物信息學分析

1.3.1pre-tae-miR172及Ap2的克隆

根據本實驗室前期建立的Dn1miRNA數據庫與已公開的miRNA數據庫miRBase(http://www.mirbase.org/)中的小麥miRNA數據,獲得tae-miR172的前體和成熟體序列。從小麥基因組數據庫Wheat URGI(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)獲取靶基因的DNA序列和蛋白序列。用Prime Primer 5.0軟件設計克隆tae-miR172的前體pre-tae-miR172及其靶基因Ap2的特異性引物(表1)。利用Plant Genomic DNA Kit(康為世紀,泰州)提取Dn1分蘗節總DNA,以總DNA為模板,以pre-tae-miR172-F/R為引物,利用2×Taq Master Mix(Dye)擴增pre-tae-miR172,PCR反應體系為20 μL,包括DNA模版1 μL,上、下游引物各1 μL,2×Taq Master Mix (Dye) 10 μL,ddH2O 7 μL。PCR反應程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環;72 ℃ 10 min。用Ultrapure RNA Kit試劑盒(康為世紀,泰州)提取Dn1分蘗節總RNA,利用Hi Script III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)試劑盒(諾唯贊,南京)將RNA反轉錄為cDNA,以cDNA為模板,以Adn1-F/R為引物,利用2×Taq Master Mix (Dye) 擴增靶基因Ap2,PCR反應體系同上。PCR反應程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環;72 ℃ 10 min。

1.3.2 生物信息學分析

根據tae-miR172的前體和成熟體序列在小麥基因組數據庫Wheat URGI獲取tae-miR172的染色體位置。利用WebLOGO(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)對miRNA成熟體序列進行堿基保守性分析。利用在線軟件RNAfold Web Sever(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)對miRNA前體進行莖環結構預測。利用psRNAtarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysis)和PRND(http://structuralbiology.cau.edu.cn/PNRD/)對tae-miR172的潛在靶基因進行預測。利用Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/)分析其蛋白結構域。用ProtParam軟件預測AP2蛋白的理化性質。下載pre-tae-miR172和AP2基因CDS上游2 000 bp的序列,利用 PlantCARE分析啟動子區域的順式作用元件。

1.4 植物表達載體的構建

在擴增pre-tae-miR172和AP2的上、下游引物5’端加上包含酶切位點的15 bp重組位點序列,分別 為5’-ACGGGGGACTCTAGAGGATCC-3’和5’-GGACTGACCACCCGGGGATCC-3’,以此新的引物進行PCR擴增,反應體系和反應程序同1.3.1。將PCR擴增產物進行膠回收。用BamHI對pBI121-GUS載體進行單酶切,使用諾唯贊公司的ClonExpress○RUltra One Step Cloning Kit將pre-tae-miR172和Ap2分別連接到酶切后的pBI121-GUS表達載體上,轉入大腸桿菌DH5α后進行搖菌,然后送哈爾濱博仕生物有限公司進行測序,最終構建pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2載體。

1.5 煙草瞬時表達試驗

參考彭瞰看[12]的方法將構建的表達載體pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2分別轉化EHA105農桿菌。然后將含有PBI121-pre-tae-miR172、pBI121-AP2的農桿菌菌液以及含有重組質粒pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2的等體積混合農桿菌菌液(OD600分別為0.5)進行煙草葉片瞬時表達試驗,以pBI121-GUS為對照。進行煙草葉片注射時,選擇生長狀態良好且顏色深綠的植株頂端附近2～3片葉。用注射器(去掉針頭)吸取1 mL農桿菌菌液從葉片背部輕輕注射菌液。每次試驗后更換手套以防污染。注射后,將幼苗在25 ℃下孵育5 d。按照Jefferson等[13]的方法,對三種處理中的GUS進行組織化學染色和定量檢測。所有處理均3次重復。

1.6 pre-tae-miR172和Ap2dn1的qRT-PCR分析

用Ultrapure RNA Kit提取冬小麥分蘗節RNA,用miRNA 1st stand cDNA Synthesis ikit試劑盒(Vazyme,南京)合成cDNA,用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,南京)對pre-ttae-miR172和Ap2進行qRT-PCR,分別以小麥U6和Actin為內參,以qAP2dn1F/R以及tae-miR172-F和mRQ3’ Primer為引物(表1)。PCR反應體系和反應程序均參照試劑盒說明書,利用2-ΔΔCT法計算pre-tae-miR172及Ap2的相對表達量。

1.7 數據統計

用Microsoft Excel 2018進行數據分析,用Graphpad Prisim 6.0軟件進行one-way或two-way方差分析(ANOVA)。

2 結果與分析

2.1 tae-miR172前體pre-tae-miR172的克隆及生物信息學分析結果

對pre-tae-miR172進行克隆并測序,發現pre-tae-miR172的長度為396 nt(圖1A)。URGI數據庫分析表明,tae-miR172位于小麥1B染色體上,其上、下游1 000 bp之間不存在mRNA,屬于基因間miRNA。對Dn1和中國春小麥的pre-tae-miR172序列進行比對,發現Dn1中該序列缺失21 nt,推測是由于品種差異性造成的(圖1B)。用WebLogo軟件分析miR172成熟體序列的保守性,發現miR172序列非常保守(圖1C)。RNAfold軟件預測發現,pre-tae-miR172形成了一個穩定的二級莖環結構(圖1D),其熱力學系綜合最小自由能為-113.10 kcal·mol-1。Dn1中miR172的這些序列特征與擬南芥中miR172的序列特征基本相似,說明miR172的功能非常保守。下載tae-miR172前體序列上游2 000 bp序列,利用PlantCARE預測啟動子區域的順式作用元件,結果(表2)表明,tae-miR172啟動子區域除含有核心元件外,還含有響應激素(脫落酸、生長素和赤霉素)和逆境脅迫(干旱)以及與生長代謝(厭氧誘導和響應光)相關的元件。

A:pre-tae-miR172的克隆結果;M:DL2000;1:pre-tae-miR172;B:pre-tae-miR172 測序結果對比;C:miR172堿基保守性分析;D:pre-tae-miR172的RNA二級結構。A: Amplicon of pre-tae-miR172; M: DL2000; 1: pre-tae-miR172; B: Sequence alignment of pre-tae-miR172; C: Motif analysis of tae-miR172; D: RNA secondary structure analysis of pre-tae-miR172.圖1 pre-tae-miR172的克隆及生物信息學分析結果Fig.1 Cloning and bioinformatics analysis result of pre-tae-miR172

表2 pre-tae-miR172和Ap2dn 1啟動子區域的順式作用元件Table 2 Analysis of cis-acting elements in promoter region of pre-tae-miR172 and Ap2dn 1

2.2 tae-miR172靶基因的克隆及生物信息學分析結果

psRNAtarget和PRND在線軟件預測發現,tae-miR172的靶基因登錄號為TRIAECS5DO2G486600.2。從小麥基因組數據庫Wheat URGI獲取靶基因的DNA序列并設計引物Adn1-F/R。以Dn1分蘗節cDNA為模板,克隆靶基因序列,發現其長度為1 650 bp(圖2A),其中CDS序列長度為1 350 bp(圖2B)。利用Pfam數據庫分析其蛋白結構域,發現其含有兩個AP2結構域(圖2C),將該靶基因命名為AP2dnl。生物信息學分析表明,AP2dnl蛋白分子量為11.088 kDa,等電點為4.93。亞細胞定位預測發現,AP2dn1蛋白位于細胞核中。PlantcARE軟件分析表明,與pre-tae-miR172啟動子區域含有的元件相比,AP2dn1啟動子區域含有茉莉酸響應元件CGTCA-motif和光響應元件sp1,而不含有生長素響應元件AuxRR-core和核心啟動子元件CATT-box(表2)。

A:AP2dn1的克隆結果;B:AP2dn1測序結果比對;C:AP2dn1結構域預測。A: Amplicon of AP2dn1; B: Sequence alignment of AP2dn1; C: Domin prediction of AP2dn1.圖2 AP2dn1基因的克隆及生物學分析結果Fig.2 Cloning and biological analysis results of AP2dn1 gene

2.3 tae-miR172靶基因AP2dn1的煙草瞬時表達驗證

利用1%的瓊脂糖凝膠對BamHI酶切后的pBI121-GUS載體進行檢測,以未酶切的載體為對照(圖3A),發現酶切后的載體比未酶切的載體小,證明該載體被線性化。隨后將pre-tae-miR172和Ap2dn1連接到酶切后的PBI121-GUS載體上,利用1%的瓊脂糖凝膠對重組載體pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2dn1進行菌落PCR檢測(圖3B和3C),發現均獲得了大小正確的條帶,表明兩個片段已被正確插入。將測序正確的菌液重新活化,并提取質粒。

A:酶切載體電泳圖;圖A中,M:DL15000;1:未酶切的pBI121-GUS載體;2:酶切后的pBI121-GUS載體。B:pBI121-pre-tae-miR172的菌落PCR結果;C:pBI121-AP2dn1的菌落PCR結果。圖B和C中,M為DL2000,1和2為兩個重復。A: Electrophoresis of enzyme digested vector;In figure A, M is DL15000, 1 is pBI121-GUS vector without digestion; 2 is pBI121-GUS vector with digestion. B: Colony PCR results of pBI121-pre-tae-miR172; C: Colony PCR results of pBI121-AP2dn1. In figures B and C, M is DL2000, 1 and 2 are two replicates.圖3 pBI121-GUS 載體構建電泳圖Fig.3 Construction of pBI121-GUS vector

利用農桿菌介導的遺傳轉化法,在煙草葉片上瞬時表達含有GUS基因的pBI121-GUS、pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2dn1載體。發現單獨接種含有pBI121-GUS載體的葉片經組織化學染色后顯示為藍色,有GUS表型;單獨接種含有pBI121-AP2dn1載體的葉片,由于AP2dn1與GUS基因上游融合,表現出與pBI121-GUS載體相似的表型;在接種含有pBI121-pre-tae-miR172載體的葉片中,GUS基因由于被tae-miR172前體剪切,因此染色后的葉片沒有觀察到GUS表型;在pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2dn1共轉化的葉片中,GUS的組織化學染色深度明顯降低(圖4)。這說明tae-miR172靶向AP2dn1。

A:pBI121-GUS;B:pBI121-pre-tae-miR172;C:pBI121-AP2dn1;D:pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2dn1的混合物。A: pBI121-GUS; B: pBI121-pre-tae-miR172; C: pBI121-AP2dn1; D: The mixture of pBI121-pre-tae-miR172 and pBI121-AP2dn1.圖4 通過組織化學染色觀察到的GUS表型Fig.4 GUS phenotype observed by histochemical staining

2.4 低溫脅迫下Dn1中pre-tae-miR172和AP2dn1的表達模式

利用qRT-PCR技術分析pre-tae-miR172及AP2dn1在5 ℃、0 ℃、-10 ℃和-25 ℃四個溫度下的表達模式。結果表明,pre-tae-miR172的表達量隨著溫度的降低呈先升后降的變化趨勢,0 ℃時表達量最高,-25 ℃時表達量最低(圖5A)。AP2dn1的表達量變化趨勢與pre-tae-miR172相反,隨著溫度的降低呈先降后升的變化趨勢,在-25 ℃表達量最高,0 ℃表達量最低(圖5B)。推測tae-miR172負調控AP2dn1的表達。

*、**和***分別表示與對照溫度(5 ℃)間在0.05、0.01和0.001水平上差異顯著。*, ** and *** indicate significant difference compared with control temperature(5 ℃) at 0.05, 0.01 and 0.001 levels, respectively.圖5 低溫脅迫下Dn1分蘗節中pre-tae-miR172(A)和AP2dn1(B)的表達模式Fig.5 Expression patterns of pre-tae-miR172(A) and AP2dn1(B) in tiller nodes of Dn1 under cold stress

3 討論

miR172是一個非常保守的miRNA,參與植物不同生長發育過程。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中,miR172與miR156相互作用,通過調控擬南芥中SPB和AP2基因的表達來控制發育時間[14-15]。在大巖桐(Sinningiaspeciosa)中,miR172通過調控AP2基因的表達來影響花器官的發育[16]。另外,miR172在植物抗逆過程中也具有重要作用,如擬南芥miR172參與對干旱脅迫的響應;大豆(Glycinemax)miR172調控根系對鹽脅迫的敏感性[17];香蕉(Musanana)miR172參與對寒冷脅迫的響應[18]。迄今為止,小麥miR172響應低溫脅迫的研究尚未見報道。在本研究中,tae-miR172前體pre-tae-miR172的表達量隨著溫度的降低呈先升后降的趨勢,在0 ℃時達到峰值,隨后逐漸下降,到-25 ℃時最低,說明Dn1中tae-miR172對低溫脅迫的響應非常靈敏,推測在Dn1抗寒過程中起調節作用。

本研究通過生物信息學預測到tae-miR172的靶基因為AP2家族基因AP2dn1,通過煙草瞬時表達試驗,說明tae-miR172負向調控AP2dn1基因的表達,這與Jung等[5]和梅 林等[19]的研究結果一致。利用qRT-PCR技術分析AP2dn1在不同溫度下的表達模式,發現AP2dn1與冬小麥抗寒有關,并起正向調控作用。由于Dn1中AP2dn1響應低溫脅迫的過程也可能受細胞內激素、光照、溫度、水分等因素的調控,具體調控機制有待進一步探究。

根據低溫脅迫程度的不同,低溫脅迫可以劃分為冷害(0～20 ℃)和凍害(<0℃)。兩種低溫脅迫都會改變植物的細胞結構、生理代謝以及蛋白活性等,從而影響植物的生長發育[20]。植物在應對冷害脅迫和凍害脅迫時存在不同的調控模式,本研究Dn1中miR172/AP2的調控模式在兩種低溫脅迫下存在差異,推測抗寒小麥品種Dn1中miR172/AP2模塊響應冷害和凍害的機制不同,需要進一步驗證。