小麥SnRK2家族基因鑒定及進化分析

韋秀蘭,蘇 寧,劉 濤,聶小軍,童 維

(西北農林科技大學農學院,陜西楊凌 712100)

植物在生長過程中經常遭遇干旱、寒冷、高溫、鹽害等非生物脅迫,對作物的生長和產量造成威脅,導致農業生產損失[1]。蛋白激酶在響應非生物脅迫過程中發揮著重要作用,其中蛋白激酶的可逆磷酸化是高等植物滲透脅迫誘導的主要信號轉導途徑之一。

SnRK(sucrose non-fermenting 1-related protein kinase)是一種在植物中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,根據序列相似性和保守結構域,可分為SnRK1、SnRK2和SnRK3三個亞家族[2]。SnRK2和SnRK3基因家族是植物特有的[3],其中SnRK2基因家族成員在植物響應滲透脅迫和脫落酸(ABA)信號轉導的過程中發揮著重要作用[4-5]。SnRK2蛋白包含三個保守功能域,分別為三磷酸腺苷(ATP)結合域、絲氨酸/蘇氨酸激酶域和一個多樣化的調節C端轉錄激活域。目前, SnRK2基因已被在擬南芥[2]、水稻[6]、玉米[7]等植物中進行了全基因組鑒定。

干旱、鹽、高溫等非生物脅迫是影響小麥生長和產量的主要限制因素。目前,已有研究對小麥部分SnRK2基因家族成員進行了功能分析。例如,TaSnRK2.7[8]和TaSnRK2.8[9]參與小麥對干旱、鹽堿和低溫脅迫的響應過程。此外,TaSnRK2.3、TaSnRK2.4和TaSnRK2.8基因均受ABA誘導表達,而TaSnRK2.7對ABA誘導無響應,表明TaSnRK2.7可能參與ABA非依賴性信號轉導通路。因此,研究小麥抗逆性和信號轉導相關基因有利于提高小麥抗逆性,降低逆境脅迫對小麥生長發育的影響,最終提高小麥產量。

最新完成的普通小麥及其祖先供體參考基因組序列信息[10]可用于在全基因組范圍內鑒定小麥SnRK2基因家族成員。本研究利用生物信息學方法,在全基因組水平上對普通小麥及其兩個祖先供體野生二粒小麥(Triticumdicoccoides)和節節麥(Aegilopstauschii)中的SnRK2基因家族成員進行鑒定,對其基因結構、系統發育、核苷酸多樣性以及逆境脅迫下的表達模式進行分析,并通過同源模型預測小麥SnRK2蛋白的三維結構,以期為小麥SnRK2基因的功能研究提供信息。

1 材料與方法

1.1 普通小麥及其兩個祖先供體SnRK2基因的全基因組鑒定

從Ensembl Plants數據庫(http://plants.ensembl.org/index.html)下載已報道的水稻和擬南芥的SnRK2蛋白序列,將其作為query序列,在普通小麥全基因組數據庫中進行BLASTP比對,設置參數為1e-5。同時從Pfam數據庫(http://pfam.sanger.ac.uk/)下載SnRK2蛋白激酶典型結構域的hmm文件PF00069和PF07714,通過HMMER 3.0軟件搜索小麥全基因組數據庫,設置參數為1e-5。然后用perl腳本對兩種方法得到的候選蛋白進行整合和去冗余,最終將候選基因提交到NCBI-CDD網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/),驗證SnRK2蛋白的保守結構域。用同樣的方法鑒定節節麥和野生二粒小麥的SnRK2基因。

1.2 普通小麥及其兩個祖先供體SnRK2基因的系統發育關系、基因結構和保守基序分析

用ClustalW軟件對普通小麥及其兩個祖先供體的蛋白序列進行多重對比,用鄰接法(NJ)構建系統發育樹,bootstrap值設為1 000。用itol進行可視化。基于普通小麥及其近緣物種的基因組注釋信息,獲得SnRK2基因的內含子/外顯子結構和染色體位置信息。用在線軟件GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制SnRK2基因結構圖,用在線軟件MEME(https://meme-suite.org/meme/)預測每個SnRK2蛋白的保守結構域,設置motif數量為10,其余參數為默認值。

1.3 普通小麥SnRK2基因的表達模式分析

從wheatURGI(https://urgi.versailles.inra.fr/files/RNASeqWheat/)和NCBI SRA數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)下載普通小麥5個組織(根、莖、葉、穗和粒)以及鹽、干旱、低溫和熱脅迫下的RNA-seq數據。然后通過Hisat 2和Stringtie軟件計算每個SnRK2基因的FPKM值,鑒定出差異表達基因。然后基于R語言pheatmap包繪制普通小麥SnRK2基因在不同組織和不同脅迫下的表達譜熱圖。

隨機選擇6個小麥SnRK2基因,驗證小麥SnRK2基因在受到干旱和鹽脅迫下的表達模式,首先將中國春小麥種子在溫室中(23±1 ℃,16 h光照/8 h黑暗)進行萌發培養。待小麥生長至三葉期時,將幼苗材料分成兩份,一份材料進行干旱處理,即在80 g·L-1的聚乙二醇(PEG6000)溶液中分別培養1、6和12 h;另一份材料進行鹽脅迫處理,即在150 mmol·L-1的NaCl溶液中分別培養6、12、24和48 h,將正常條件下生長的幼苗作為對照。所有樣品的葉片均來自3次獨立重復試驗,以肌動蛋白基因(Actin)作為內參。用Plant RNA Kit試劑盒(Omega,美國)提取這些樣品的RNA。用反轉錄試劑盒Reverse Transcriptase M-MLV(RNaseH-)(TaRaKa,日本)合成cDNA第一鏈。參照SYBR Premix Ex TaqII(TaKaRa,日本)說明書的反應體系,在Quant Studiotm 7 Flex系統(Thermo,美國)進行qRT-PCR。PCR反應程序:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性3 s,60 ℃退火30 s,共40個循環。每個樣品設置3個生物學重復。用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

1.4 普通小麥及其近緣物種SnRK2基因的單倍型和核苷酸多樣性分析

從NCBI上下載93份六倍體、二倍體和四倍體小麥的全基因組重測序數據(PRJNA476679)獲取SNP信息。用Samtools軟件包中的bcftools,根據位置信息提取小麥SnRK2基因內含子和外顯子區域的SNP位點。用vcftools計算核苷酸多樣性(Pi)和分化指數(Fst),以探究SnRK2基因在普通小麥形成過程中受到的選擇壓力。根據重測序數據獲得的SNP信息,利用perl腳本對每個SnRK2基因的單倍型進行計數,分析野生二粒小麥、硬粒小麥、農家種和栽培品種的單倍型。同時,對重測序材料的農藝性狀進行統計分析,探討基因型變異與植株性狀之間的關系。

1.5 小麥SnRK2蛋白三維結構預測

將候選蛋白序列提交到PDB數據庫(http://www.rcsb.org/),搜索并下載最優的小麥SnRK2同源模板蛋白。利用PSI-BLAST比對小麥SnRK2和模板蛋白的序列,然后用Swiss-Model軟件(https://swissmodel.expasy.org/interactive/)預測SnRK2蛋白的三維結構,用Pymol軟件進行可視化。

2 結果與分析

2.1 小麥SnRK2基因結構和保守基序分析

通過BLASTP和HMMER從普通小麥、節節麥和野生二粒小麥基因組中分別鑒定到30、10和19個SnRK2候選基因,將這些候選基因進行系統進化分析。結果(圖1)顯示,這些基因被分為3個亞家族。基因結構分析顯示,這些基因的序列長度范圍為1 901～6 652 bp,其中Ta-5A-SnRK2.26序列最長,為6 652 bp。此外,大部分普通小麥SnRK2基因的序列長度和外顯子/內含子結構與其祖先供體節節麥、野生二粒小麥的同源基因相似,但UTR區域和外顯子長度存在差異。相同亞家族成員之間的基因結構較為相似,而不同亞家族成員之間存在一定差異。在亞家族I中,Ta-2A-SnRK2.10和Ta-2B-SnRK2.14基因含有2個內含子,Ta-2D-SnRK2.18基因含有3個內含子外,其余小麥SnRK2基因以及大部分節節麥和野生二粒小麥SnRK2基因均含有8個內含子;在亞家族II中,所有小麥SnRK2基因及其祖先物種均含有8個內含子;在亞家族III中,Ta-4A-SnRK2.22、Ta-4B-SnRK2.23和Ta-4D-SnRK2.24含有7個內含子,其他小麥SnRK2基因及大部分節節麥和野生二粒小麥SnRK2基因均含有8個內含子。

圖1 小麥及其兩個祖先供體SnRK2基因的系統發育關系(A)、保守基序(B)和基因結構(C)分析Fig.1 Phylogenetic relationship(A), conserved motifs(B) and gene structure(C) of SnRK2 genes in wheat and its two progenitors

利用MEME在線工具對這些SnRK2蛋白的保守結構域組成和數量進行預測,共鑒定到10個保守的基序,且不同蛋白中這些基序的排列順序基本一致(圖1)。通過序列比對發現,所有SnRK2蛋白都含有motif 8和motif 3。Motif 2和motif 4分別是ATP結合域和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域,在大部分成員中均存在。進一步分析發現,亞家族I所有成員都含有10個motif;但亞家族II的成員除均含有motif 1～8外,均缺少motif 9或motif 10;亞家族III所有成員均缺少motif 9。表明同一亞家族成員間具有相似的基序組成,而不同亞家族成員間具有各自特定的基序,推測不同亞家族間可能已經發生了功能分化。

2.2 小麥SnRK2基因的表達模式

利用RNA-seq數據分析SnRK2基因在小麥不同組織中的表達模式,結果(圖2)顯示,小麥SnRK2的表達具有顯著的組織特異性。其中,Ta-1A-SnRK2.1、Ta-1B-SnRK2.3、Ta-1D-SnRK2.5和Ta-5D-SnRK2.29基因在根中高表達,而其他基因在根中不表達或表達量較低,表明這4個基因在根系形態學建成中具有重要功能。Ta-2D-SnRK2.17和Ta-4D-SnRK2.24基因在籽粒中高表達,而在其他組織中表達量較低,推測這兩個基因可能在小麥種子發育過程中起重要作用。此外,Ta-2D-SnRK2.15在葉、根和莖中高表達,Ta-3D-SnRK2.21在莖和穗中高表達,表明這兩個基因可能在莖發育中均發揮重要作用。

根據自卸車的實際工作運行情況，在環境溫度16℃，油液溫度23℃環境條件下進行了油液溫升試驗。第一階段自卸車持續運行約2.5h。第二階段自卸車停止運行，液壓系統自然冷卻1.5h。第三階段自卸車繼續運行約2h。

Grain:籽粒; Leaves:葉片; Spike:穗; Root:根; Stem:莖.圖2 SnRK2基因在小麥不同組織中的表達譜Fig.2 Expression profiles of SnRK2 gene in different tissues of wheat

進一步利用RNA-seq數據分析小麥SnRK2基因在不同逆境脅迫下的表達模式。結果(圖3)表明,干旱脅迫處理下,Ta-2D-SnRK2.15基因在處理1 h后表達量較高,在處理6 h后表達量有所降低;Ta-1A-SnRK2.1、Ta-1B-SnRK2.3、Ta-1D-SnRK2.5和Ta-2D-SnRK2.17基因在處理1 h后表達水平較低,但在處理6 h后表達量明顯提高。鹽脅迫處理下,大部分SnRK2基因的表達量在處理6 h后上調表達,但隨著鹽脅迫時間的延長,這些基因的表達量并沒有明顯提高,甚至部分基因(如Ta-1A-SnRK2.1、Ta-3A-SnRK2.19和Ta-3B-SnRK2.20)在處理24 h后有所下降。低溫脅迫(4 ℃)處理下,Ta-2A-SnRK2.9和Ta-2D-SnRK2.17基因上調表達;而Ta-2D-SnRK2.16和Ta-5D-SnRK2.29基因下調表達。熱脅迫處理下,大部分SnRK2基因的表達量隨著處理時間的延長而逐漸提高,其中Ta-5B-SnRK2.27和Ta-5D-SnRK2.29在處理6 h后明顯上調表達。這些結果表明,小麥SnRK2基因家族在響應不同非生物脅迫過程中均發揮重要作用,但不同成員發揮的功能不同。

CK:對照; Drought 1h: 干旱處理1 h; Drought 6h: 干旱處理6 h; Salt 6h: 鹽處理6h; Salt 12h: 鹽處理12 h; Salt 24h: 鹽處理24 h; Salt 48h: 鹽處理48 h; 23℃: 23 ℃正常處理; 4℃: 4 ℃低溫處理; Heat 1h: 熱處理1 h; Heat 6h: 熱處理6 h.圖3 小麥SnRK2基因在不同脅迫下的表達譜Fig.3 Expression profiles of wheat SnRK2 genes under different stresses

選擇來自兩個部分同源染色體的6個小麥SnRK2基因,利用qRT-PCR驗證其在干旱和鹽脅迫下的表達模式。結果(表1)表明,6個小麥SnRK2基因在干旱和鹽脅迫下存在明顯的表達差異,整體表達趨勢與RNA-seq結果一致,但是位于相同部分同源染色體的基因間表達水平存在明顯差異。位于第一部分同源染色體的3個基因中,Ta-1D-SnRK2.5基因的表達量在干旱和鹽脅迫各個時間點均顯著高于Ta-1A-SnRK2.1和Ta-1B-SnRK2.3。與對照處理相比,除干旱脅迫12 h后Ta-1A-SnRK2.1基因的表達量有所提高以及Ta-1D-SnRK2.5基因的表達量無明顯變化外,3個基因的表達量在干旱脅迫各時間點均有所降低;3個基因的表達量在鹽脅迫6 h后均有一定程度的增加,且明顯高于對照處理,之后隨著脅迫時間的延長有不同程度的降低。位于第二部分同源染色體的3個基因中,Ta-2A-SnRK2.10基因的表達量在干旱和鹽脅迫各個時間點均顯著高于Ta-2B-SnRK2.14和Ta-2D-SnRK2.18;與對照處理相比,3個基因的表達量在干旱脅迫各時間點均有所下降;Ta-2A-SnRK2.10和Ta-2B-SnRK2.18基因的表達量在鹽脅迫6 h后明顯高于對照處理,隨著脅迫處理時間的延長,3個基因的表達均受到不同程度的抑制。表明這些基因在調控脅迫信號轉導過程中發揮著不同的作用。

表1 干旱脅迫和鹽脅迫下小麥SnRK2基因的表達量Table 2 Expression levels of wheat SnRK2 genes under drought and salt stresses

2.3 小麥SnRK2基因的核苷酸多樣性

在小麥馴化過程中,純化選擇的預期結果之一是附近基因位點遺傳多樣性的下降。因此,在從野生二粒小麥到硬粒小麥的進化過程中,A和B亞基因組中絕大多數SnRK2基因的Pi值都呈現下降趨勢,尤其Ta-5B-SnRK2.28基因的Pi值下降最為明顯(圖4),基因的核苷酸多樣性與進化時的選擇壓力有關,說明該基因在進化時經歷了強烈的選擇壓力;同時,從農家種到栽培品種的改良過程中也出現了類似的下降趨勢,但下降幅度比前者小。為探究小麥及其祖先物種在進化過程中的分化程度,利用重測序數據對不同群體間的Fst進行分析(圖5)。從A和B亞基因組來看,野生二粒小麥和硬粒小麥之間SnRK2基因的Fst普遍高于硬粒小麥和農家種以及農家種和栽培品種之間SnRK2基因的Fst,其中農家種和栽培品種之間的Fst最低。值得注意的是,Ta-5B-SnRK2.28基因在從野生二粒小麥到硬粒小麥的進化過程中Fst較高(圖5),表明該基因與鄰近區域遺傳位點在馴化過程中存在明顯分化。

B亞基因組上所有小麥SnRK2基因的位置用藍點標出,Ta-5B-SnRK2.28位于第5B染色體上。圖5同。All the wheat SnRK2 genes on B subgenome were highlighted using blue dots. Ta-5B-SnRK2.28 was located on chromosome 5B. The same in table 5.圖4 小麥SnRK2基因在B亞基因組上的核苷酸多樣性指數(Pi)Fig.4 Nucleotide diversity index(Pi)of wheat SnRK2 genes on B subgenome

圖5 小麥SnRK2基因在B亞基因組的群體分化指數(Fst)Fig.5 Population divergence(Fst) of wheat SnRK2 genes on B subgenome

2.4 小麥SnRK2基因的單倍型

基于Ta-5B-SnRK2.28進行單倍型分析,發現在野生二粒小麥中有GG、AG和AA三種單倍型,而在硬粒小麥中只有AA一個單倍型(圖6)。在六倍體農家種也存在GG、AG和AA三種單倍型,而六倍體栽培品種中只有AA一種單倍型。說明從野生二粒小麥到硬粒小麥的馴化以及六倍體農家種到六倍體栽培品種的改良過程中,GG、AG單倍型的消失以及AA單倍型的迅速擴大可能是人工選擇的結果。根據單倍型對材料進行分類后,重測序材料的表型差異證實了該觀點。具有AA單倍體的六倍體小麥種子長度更短,種子更寬,千粒重更高,滿足小麥籽粒改良的預期要求。

圖6 Ta-5B-SnRK2.28基因的單倍型分析Fig.6 Haplotype analysis of Ta-5B-SnRK2.28 gene

2.5 小麥SnRK2蛋白的三維結構

選取位于三個部分同源染色體的9個小麥SnRK2蛋白,采用同源建模方法預測其三維結構(圖7)。結果表明,9個小麥SnRK2蛋白的RMSD值(根均方偏差)均小于1.5?(表2),說明這些蛋白具有相似的三維結構。特別是Ta-5A-SnRK2.26、Ta-5B-SnRK2.27、Ta-5D-SnRK2.30蛋白間具有完全相同的三維結構模型,RMSD值均為0,可見這3個基因在進化過程中結構高度保守。

表2 小麥SnRK2蛋白間三維結構的均方根偏差 (RMSD)Table 1 Root-mean-square deviation(RMSD) of the predicted three-dimensional structure between different wheat SnRK2 proteins

圖7 小麥SnRK2蛋白的三維結構Fig.7 Three-dimensional structure of wheat SnRK2 proteins

3 討論

基因的差異表達在一定程度上反映該基因的功能。Sun等[12]研究表明,小麥SnRK2基因在根、葉、花、籽粒等組織中的表達具有特異性。本研究發現,Ta-2D-SnRK2.17和Ta-4D-SnRK2.24基因在籽粒中表達量較高,而在其他組織中表達量較低或不表達,推測這兩個基因在小麥種子發育過程中發揮重要作用。Ta-1A-SnRK2.1、Ta-1B-SnRK2.3、Ta-1D-SnRK2.5和Ta-5D-SnRK2.29基因在根中表達量最高,推測這四個基因在根系形態學建成中具有重要功能。此外,SnRK2還參與干旱、鹽、ABA等多種非生物脅迫響應過程[14-16]。本研究發現,在干旱脅迫6 h后,大部分小麥SnRK2基因有不同程度的響應,這與Fatima等[17]的報道一致。其中,Ta-2B-SnRK2.13和Ta-1A-SnRK2.2在干旱處理6 h后表達量較高,而在其他脅迫處理中表達量較低或不表達,表明這兩個基因在響應干旱脅迫過程中具有重要的調控作用。qRT-PCR分析結果顯示,小麥SnRK2基因A、B和D亞基因組三個同源拷貝的表達水平存在顯著差異。推測小麥SnRK2基因家族同源基因在異源多倍體化過程中發生了功能分化,導致同源基因對不同脅迫表現出不同的響應。

本研究結合小麥重測序數據,從群體遺傳學的角度分析了SnRK2基因在不同材料中的基因型差異,推測小麥馴化過程中的人工選擇是導致SnRK2基因位點遺傳多樣性下降的原因之一。同時,大部分SnRK2的Pi值從野生二粒小麥到硬粒小麥的馴化過程中明顯降低,從六倍體農家種到六倍體栽培品種的改良過程中也略有降低,這一結果也表明,馴化對遺傳多樣性的影響大于改良。此外,野生二粒小麥和硬粒小麥之間SnRK2基因的Fst普遍高于硬粒小麥和六倍體農家種以及六倍體農家種和六倍體栽培品種之間SnRK2基因的Fst,說明從野生四倍體小麥到栽培四倍體小麥的分化程度更高。Ta-5B-SnRK2.28的單倍型表型分析進一步證明了本研究觀點。本研究為分析六倍體小麥的基因功能提供了參考信息,并為小麥育種提供了重要的基因資源。