和田羊FGF5基因RNA干擾載體構建及篩選

曹少奇，陳巖，高新梅，喻恒彬，王靜*，胡廣東*

（ 1.新疆維吾爾自治區畜牧總站，新疆 烏魯木齊 830000 ； 2.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832061 ）

和田羊是歷史悠久的地方半粗毛羊品種，但由于育種工作落后，導致生產性能發生退化。因此，對控制和田羊羊毛的性狀相關基因進行深入研究，進一步改善和田羊的羊毛品質，對和田羊種質資源的開發與保護具有重要意義[1]。毛囊是支持哺乳動物毛發形成和生長的重要器官，其周期受血管內皮細胞生長因子[2]、骨形態發生蛋白4[3]、胰島素樣生長因子1[4]、FGF5[5]等多種信號分子的調控，FGF5是控制毛囊從生長期向退行期轉換的關鍵因子[6]。FGF5由3個外顯子和兩個內含子構成，具有調控毛囊周期的功能，是調節毛發生長的重要因子之一。在對小鼠、驢、犬、貓、人的試驗中均發現FGF5基因的表達量與毛發生長有關，也有研究發現FGF5基因的表達與絨山羊的羊絨生長有關[7]。綜上，沉默或敲除FGF5因子研究其對動物產毛性狀的影響，對提高產毛動物的毛產量具有重要意義。

對絨山羊中使用RNAi技術進行FGF5敲除試驗，結果表明，RNAi技術可有效降低FGF5的表達[8-9]，且FGF5敲除后對絨山羊的血液生理生化指標[10]、發情能力[11]無顯著影響。本研究中設計并合成了4個shRNA，將其與pGPU6/GFP/Neo質粒連接構建干擾表達載體，將干擾載體轉染至和田羊成纖維細胞，檢測其對和田羊FGF5基因的mRNA和蛋白表達水平的干擾效率，篩選出干擾效率最強的shRNA，為進一步探討和田羊中FGF5基因的作用機制、改善和田羊毛質量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用和田羊由石河子大學獸醫站飼養，剪取和田羊耳部組織分離培養獲得成纖維細胞。

大腸桿菌DH5α購自天根公司；質粒pGPU6/GFP/Neo購自上海吉瑪技術有限公司。

胎牛血清（FBS）、DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶購自Gibco；20×PBS、質粒提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；青霉素-鏈霉素（HyClone）；Trizol（Invitrogen公司）；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒（TaKaRa公司）；抗GADPH鼠單克隆抗體、抗FGF5鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（Abcam公司）。

CO2培養箱（Thermo公司）、超凈工作臺（日本日立公司）、LightCycler 96實時熒光定量PCR儀（羅氏公司）；垂直電泳儀、凝膠成像系統、半干轉膜儀（美國BIO-RAD公司）；水平板電泳儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 和田羊FGF5基因靶向寡核苷酸的設計與制備

依據和田羊FGF5基因CDS區與shRNA的設計原則，使用Life Technologies公司網站（http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/brands/ambion.html）中的shRNA target design工具，設計得到4條長度為54 bp的shRNA干擾片段PR-FGF1、PR-FGF2、PR-FGF3、PR-FGF4和1條長度為51 bp的陰性對照片段PR-FGF5，片段序列信息見表1。

表1 FGF5 RNA干擾片段序列信息Tab.1 FGF5 RNA interference fragment sequence information

shRNA干擾片段上下游分別引入BamH Ⅰ酶切位點和Bbs Ⅰ酶切位點，由上海生工生物工程有限公司合成相應的shDNA單鏈。

1.3 RNA干擾載體的構建

將所得的單鏈shDNA使用20 μL體系（Sense 1 μL、10×SSC 1 μL、Anti-Sence 1 μL、ddH2O補齊）進行退火連接；反應條件為95 ℃變性10 min，室溫冷卻1 h；獲得雙鏈shDNA。

4條干擾片段分別命名為shRNA-FGF1、shRNAFGF2、shRNA-FGF3、shRNA-FGF4，陰性對照片段命名為shRNA-FGF5。使用限制性內切酶BamH Ⅰ和Bbs Ⅰ對質粒pGPU6/GFP/Neo進行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行回收，得到線性化的質粒pGPU6/GFP/Neo。將合成的5條雙鏈shDNA，分別與線性化的pGPU6/GFP/Neo質粒4 ℃過夜連接，連接產物轉化入感受態細胞中，過夜挑取單菌落至培養管，搖菌擴大培養，進行質粒提取后獲得重組質粒。重組質粒利用BamH Ⅰ進行單酶切鑒定后，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 重組質粒酶切鑒定

重組質粒酶切體系為：10×buffer H 1 μL，BamH Ⅰ酶0.5 μL，BSA（10 g/L）0.25 μL，質粒4 μL，滅菌超純水補至10 μL。離心混勻后，置37 ℃水浴2 h；65 ℃經10 min滅活內切酶，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 細胞培養和細胞轉染

采取和田羊耳部組織塊，使用PBS溶液（含有50萬單位青霉素-鏈霉素）清洗，之后用75%酒精浸泡2 min，再次使用PBS溶液仔細清洗。在超凈工作臺中將組織塊表皮去除，在PBS溶液中將組織塊剪碎至糊狀，使用PBS溶液離心清洗3～5遍，胰酶消化后再次使用PBS溶液離心清洗3～5遍，將清洗后的組織塊種至60 mm培養皿中，在細胞培養箱（37 ℃、5% CO2）中放置5 min，待組織塊貼壁后取出，在培養皿中添加含有10% FBS的DMEM/DF12完全培養基（含有20萬單位青霉素-鏈霉素），放入細胞培養箱中培養，2 d后更換培養基，4 d后可見耳部組織塊周圍遷移出成纖維細胞，2 d更換一次培養基繼續培養至細胞數量可用。利用電刺激轉染的方式將5種RNA干擾載體轉染至成纖維細胞，24 h后觀察綠色熒光蛋白GFP6表達情況。

1.6 RT-PCR檢測FGF5 mRNA表達水平

電轉染24 h后，使用TRIzol試劑盒提取各組細胞的總RNA，反轉錄為cDNA通過RT-PCR檢測細胞樣品中FGF5基因表達量，重復3次。定量引物序列為：AAGACTGGGCGGGAGTGGTA；GGCTTGACGGGATTAGGTG。采用2-ΔΔCt法計算FGF5基因的相對表達量。

1.7 WB檢測FGF5蛋白表達水平

電轉染36 h后，棄掉培養液，使用RIPA裂解液裂解各組細胞提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度并計算出SDS-PAGE電泳上樣量，電泳至溴酚藍剛跑出，半干轉法轉膜，之后用5%脫脂奶粉室溫搖床孵育，封閉1 h。剪取一次性塑料手套指頭部分，將膜放入其中，將稀釋好的一抗滴到膜上，使用封口機封口，4 ℃過夜孵育。TBST洗膜2次，向50 mL離心管中加入稀釋過的二抗，將膜放入其中，室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜2次。使用HRP-ECL發光法進行鑒定，確定FGF5蛋白表達量。

1.8 數據統計與分析

使用SPSS 19.0統計學軟件對轉染后的成纖維細胞中FGF5基因表達量進行單因素方差分析。P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 和田羊FGF5基因shRNA干擾載體的構建與鑒定結果

將合成的5條寡聚核苷酸片段與pGPU6/GFP/Neo載體連接，轉化、挑菌、搖菌、質粒提取，獲得重組質粒。重組質粒利用BamH Ⅰ進行單酶切鑒定，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，重組質粒pGPU6-shRNA BamH Ⅰ單酶切鑒定結果見圖1。

圖1 重組質粒pGPU6-shRNA BamH I單酶切鑒定Fig.1 Gel electrophoresis of recombinant interference vector with single enzyme digestion

由圖1可知，BamH Ⅰ單酶切后5個重組質粒均只出現1條條帶，且大小符合預期。將提取的質粒送公司測序，測序結果與設計序列相符，表明4個干擾表達載體均構建成功，pGPU6-shRNA載體圖譜見圖2。

圖2 pGPU6-shRNA載體圖譜Fig.2 PGPU6-shRNA vector map

將5個pGPU6-shRNA的載體分別命名為pGPU6-shRNA-FGF1（即PR-FGF1）、pGPU6-shRNA-FGF2（即PR-FGF2）、pGPU6-shRNA-FGF3（即PR-FGF3）、pGPU6-shRNA-FGF4（即PR-FGF4）、pGPU6-shRNAFGF5（即PR-FGF5）。

2.2 綿羊耳部成纖維原代細胞及質粒轉染細胞（見圖3）

圖3 綿羊耳部成纖維原代細胞及質粒轉染細胞Fig.3 Sheep ear fibroblasts primary cells and plasmid transfected cells

由圖3（a）可知，培養2 d后組織塊周圍遷移出綿羊耳部成纖維細胞；由圖3（b）可知，組織塊培養培養4 d后成纖維細胞的細胞密度約為80%。

利用電激轉染的方式將5種RNA干擾載體轉染至成纖維細胞，24 h后通過熒光顯微鏡觀察熒光情況。

由圖3（c）、3（d）可知，轉染后細胞可見綠色熒光，表明成纖維細胞中開始表達外源綠色熒光蛋白，干擾載體轉染成功。

2.3 干擾載體對FGF5基因沉默效率檢測結果

以轉染陰性質粒PR-FGF5的成纖維細胞為對照，采用qRT-PCR檢測成纖維細胞轉染4個干擾載體和陰性質粒后FGF5基因mRNA表達量，結果見圖4。

圖4 重組質粒轉染后FGF5 mRNA表達量Fig.4 Expression of FGF5 mRNA after transfection with recombinant plasmid

由圖4可知，4個shRNA干擾表達載體均能夠不同程度干擾成纖維細胞中FGF5 mRNA的表達。PR-FGF1組、PR-FGF2組、PR-FGF3組、PR-FGF4組干擾效率分別為23.91%、58.85%、85.20%、43.59%，均顯著低于PR-FGF5組（P＜0.05），其中重組質粒PR-FGF3對FGF5基因的干擾效率最高。

以轉染陰性質粒PR-FGF5的成纖維細胞為對照，以GAPDH為內參蛋白，采用WB檢測成纖維細胞轉染4個干擾載體和陰性質粒后FGF5蛋白表達量，結果見圖5。

圖5 重組質粒轉染后FGF5蛋白表達量Fig.5 Expression level of FGF5 protein after transfection with recombinant plasmid

由圖5可知，與PR-FGF5組相比，PR-FGF1組、PRFGF2組、PR-FGF3組、PR-FGF4組中FGF5蛋白表達量均明顯降低。其中，PR-FGF3組中FGF5蛋白表達量降低最顯著，WB結果與qRT-PCR結果趨勢相同。

結果表明，PR-FGF3 RNA干擾片段抑制FGF5基因表達效果最佳。

3 討論

成纖維細胞生長因子（FGFs）屬于多肽類生長因子，通過與酪氨酸激酶型FGF受體（FGFRs）結合發揮作用[12]。目前在單細胞動物中并未發現FGFs基因，已發現的FGFs與FGFR基因全部存在于多細胞動物中。線蟲中存在兩種FGFs，人和小鼠中存在23種FGFs，因此，FGFs基因種類可能隨著生物的進化不斷增多，并構成越來越復雜的調控網絡，參與更多的生物學功能。據此，深入研究FGFs及其受體FGFRs基因的調控網絡將為研究動物生長、生理調控過程和演化中生物功能的變化奠定基礎。

FGF5是FGFs家族的一員，廣泛存在于多種哺乳動物中。但有研究發現，不同動物中FGF5蛋白存在明顯的區別，目前，FGF5在人和小鼠體內的主要作用是調控毛囊生長，是已知最有效的誘導毛囊從生長期轉換到休止期的因子。FGF5在毛囊生長期末期高表達，可促進毛囊從生長期至退行期的轉換，從而抑制毛發生長[13]。采用RNAi技術或FGF5抑制劑對FGF5基因進行抑制后，FGF5蛋白表達量降低，毛囊生長期被延長。

與野生型小鼠相比，通過基因打靶技術敲除FGF5基因的小鼠毛發生長速度明顯升高[14]，FGF5基因敲除的綿羊羊毛長度和產量均有所提高[15]。研究表明，FGF5抑制因子對人類脫發具有治療效果[16]，也可以促進小鼠毛發生長[17]。FGF5能夠改變真皮乳頭細胞的活性，抑制真皮乳頭細胞介導的外跟梢細胞的增殖，進而調控毛囊周期，抑制毛發生長，誘導毛發再生[18]。研究發現，將綿羊的FGF5敲除后，FGFR1、雄激素、Wnt/β-catenin、Shh/Gli2、c-MYC等因子產生了變化并存在一些相互作用[19]。有研究表明，FGF5可影響綿羊毛囊發育與毛發生長[20]。綜上所述，在生物、細胞、分子水平上繼續深入研究FGF5對毛發發育的影響具有重要的意義和較高的可行性。

本研究通過RNAi技術構建并篩選出了干擾效率達到85.2%的和田羊成纖維細胞FGF5基因干擾載體，可作為后續和田羊FGF5的RNAi序列，為研究FGF5對和田羊羊毛生長的調控、改善和田羊羊毛質量提供技術支持。在此基礎上，可進一步在其他毛囊相關細胞中進行FGF5敲除試驗，以探究FGF5在毛囊周期調控網絡中的作用；同時可將FGF5基因干擾與FGF5抑制劑進行對比，探究FGF5抑制劑應用于和田羊毛生產的可能性。

4 結論

本研究構建并篩選出了和田羊FGF5基因的干擾表達載體，經細胞驗證可高效干擾和田羊FGF5基因的表達，可應用于和田羊FGF5基因功能的研究中。