微生物法測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的不確定度評定

高利海，陳秋明，鐘燕華

（精益和泰質量檢測股份有限公司，廣東廣州 510700）

葉酸是一種水溶性維生素，又名蝶酰谷氨酸，在自然界主要以蝶啶、對氨基苯甲酸和谷氨酸3種成分結合成母體化合物而存在[1]。葉酸在蛋白質合成及細胞分裂與生長過程中具有重要作用，缺少時會造成紅細胞中血紅蛋白減少、細胞發育停滯，出現巨幼紅細胞性貧血疾病[2]。

目前，用來檢測食品中葉酸含量的常用方法有儀器法（如高效液相色譜法）、試劑盒法（酶聯免疫吸附法）和微生物法等[3-5]。其中，微生物法是國內外普遍采用的檢測方法，也是我國食品安全國家標準推薦檢測方法，但微生物生長影響因素較多，檢測方法操作煩瑣，容易造成結果偏差。因此，為提高試驗檢測結果的準確性與可靠性，本文依據RB/T 151—2016及GB 5009.211—2022等標準評估了微生物法測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的不確定度分量，進而對其進行合成與擴展，用來表征葉酸真值含量范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設備

CPA225D電子天平（精度0.1 mg）、QUINTIX513-1CN電子天平（精度0.01 mg）來源于賽多利斯；GNP-9270恒溫培養箱來源于精宏；Cary60紫外可見分光光度計來源于安捷倫。

1.3 方法

按《食品安全國家標準 食品中葉酸的測定》（GB 5009.211—2022）規定的方法檢測嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量。

2 結果與分析

2.1 不確定度分量來源

根據《測量不確定度的要求》（CNASCL01-G003:2021）、《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》（RB/T 151—2016）等文件評定不確定度，確定影響檢測結果的主要因素包含重復性測量、標準品稱量、標準溶液配制及系列管制備、試樣稱量、試樣溶液配制及系列管制備、儀器偏差及標準曲線擬合等幾個方面。

2.2 各影響因素的相對標準不確定度評定

2.2.1 重復性測量

按照國標方法對嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量進行6次平行測定，重復性測量產生的標準不確定度屬于A類不確定度。重復性測定結果見表1。

表1 重復性測定結果

根據貝塞爾公式計算標準差為

晞月眼眸如波，朝著青櫻淺淺一漾，溫柔的眼眸中閃過一絲不馴，她柔聲細語：“妹妹與我都是側福晉，我怎敢不隨侍在主子娘娘身邊？”她頓一頓，“而且，主子娘娘醒來，未必喜歡看見妹妹。”

同一個樣品重復進行2次測定，結果取平均值，計算標準不確定度為

則相對標準不確定度為

2.2.2 標準品稱量

根據使用的電子天平（精度為0.01 mg）的檢定證書可知，當0.01 mg≤m≤5 g時，允差為±0.5 mg，采用矩形分布，包含因子為計算標準不確定度為

試驗使用減重法稱取20.0 mg葉酸標準品，稱重2次，1次為去皮空盤質量，1次為總質量，計算標準不確定度為=0.409mg，則相對標準不確定度為urel(m標)=0.409/20=0.020 5。

2.2.3 標準溶液配制

根據《移液器檢定規程》（JJG 646—2006）、《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）查得所使用容量瓶和移液器的最大允許誤差，結合使用次數與器具容量，計算各器具的相對標準不確定度（假設矩形分布，包含因子為），結果見表2，則標準溶液配制的相對標準不確定度為

表2 標準溶液配制引入的各相對標準不確定度

2.2.4 標準系列管制備

根據《移液器檢定規程》（JJG 646—2006）查得使用移液器的最大允許誤差，結合吸取溶液體積，計算各器具的相對標準不確定度（假設矩形分布，包含因子為），結果見表3，則標準系列管的相對標準不確定度為

表3 標準系列管制備引入的各相對標準不確定度

合成上述2.2.2、2.2.3、2.2.4各因素引入的相對標準不確定度為

2.2.5 試樣稱量

根據使用的電子天平（精度為0.001 mg）的檢定證書可知，當0.02 g≤m≤50 g時，允差為±0.5 mg，采用矩形分布，包含因子為計算標準不確定度為

試驗使用減重法稱取0.500 g試樣，稱重2次，1次為去皮空盤質量，1次為總質量，則標準不確定度為=0.409mg，則相對標準不確定度為urel(m樣)=0.409/500=0.000 818。

2.2.6 試樣溶液配制

根據《移液器檢定規程》（JJG646—2006）、《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）查得所使用容量瓶和移液器的最大允許誤差，結合使用次數與器具容量，計算各器具的相對標準不確定度（假設矩形分布，包含因子為），結果見表4，則試樣溶液配制的相對標準不確定度為

表4 試樣溶液配制引入的各相對標準不確定度

2.2.7 試樣系列管制備

根據《移液器檢定規程》（JJG 646—2006）查得使用移液器的最大允許誤差，結合移液器吸取體積，計算相對標準不確定度（假設矩形分布，包含因子為），結果見表5，則試樣系列管制備的相對標準不確定度為

表5 試樣系列管制備引入的各相對標準不確定度

合成上述2.2.5、2.2.6、2.2.7各因素引入的相對標準不確定度為

2.2.8 標準曲線擬合

標準曲線線性回歸方程y=0.679 8x+0.255 9，截距a=0.255 9，斜率b=0.679 8。測定次數為27，測試點數據見表6，則殘差的標準差為

各標準溶液濃度的離均差平方和為

式中：Ci為各標準溶液葉酸含量，ng；為各標準溶液葉酸含量平均值，為0.439 ng。

按照GB 5009.211—2022，試樣系列管中分別加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL試樣稀釋液，每個梯度做3個平行，即測定9次，測得吸光值，葉酸含量見表7。

表7 試樣管葉酸含量

計算標準曲線擬合引入的標準不確定度為

標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為

2.2.9 紫外可見分光光度計

根據儀器校準證書可知，包含因子k=2，置信概率95%，擴展不確定度為0.2%，則計算其相對標準不確定度urel(S5)=0.002/2=0.001。

2.3 各影響因素的相對標準不確定度合成、擴展及表示

2.3.1 各影響因素的相對標準不確定度分量合成、擴展

各影響因素的相對標準不確定度如表8所示，則合成相對標準不確定度為

表8 各影響因素的相對標準不確定度分量

當包含因子k=2，置信概率95%，計算其相對擴展不確定度Urel=0.039×2=0.078 6。

2.3.2 測量不確定度表示

按照標準規定方法測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量，均值為66.1 μg/100 g，擴展不確定度為U95=0.078 6×66.1 μg/100 g=5.2 μg/100 g，包含因子k=2，置信概率95%。

3 結論

通過分析和評估測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的不確定度分量可知，影響較大的因素是重復性測量、標準溶液配制、標準曲線擬合，其中標準溶液配制影響較大是標準品稱量與標準系列管制備，相對標準不確定度分別為0.020 5和0.017 6，標準曲線擬合相對標準不確定度為0.023。因此試驗過程中要嚴格按照標準規定，規范實驗操作流程，加強人員培訓，從而獲得更好重復性，同時盡量使用高精密度電子天平稱量標準品，購買正規廠家玻璃器皿，定期計量和維護，對檢測儀器要定期校準，以確保檢驗結果的準確性。