基于FRET的熒光猝滅法在食品檢測中的應用

徐思凡

（江西省檢驗檢測認證總院食品檢驗檢測研究院，江西南昌 330052）

熒光法具有快速、操作簡單和靈敏度高等優點，被廣泛應用于結晶紫（Crystal Violet，CV）的檢測。近年來，以金納米簇為代表的納米熒光材料獲得越來越多的關注。金納米簇的熒光性質與自身尺寸有關，當其粒徑接近于電子的費米波長（0.5 nm）時，表現出類似分子的性質，如HOMO-LUMO躍遷和熒光特性等。隨著金核數量的增加，熒光將會發生紅移，這使金納米簇具有可調節的熒光波長[1]。長波長發射的金納米簇可以很好地降低生物自體的背景熒光干擾，為生物樣品的實際檢測提供了基礎。此外，由于銀原子擁有和金原子相似的尺寸和化學性質，故在金納米簇合成過程中，銀的加入使二者表現出協同效應，使雙金屬納米簇表現出比單一金屬納米簇更大的尺寸以及更強的熒光和催化活性。因此，本文以生物質材料鴨蛋清為模板采用簡單的微波法快速制備了具有長波長熒光發射的鴨蛋清金銀納米簇（Duck Egg White-AuAg Nanoclusters，DEW-AuAgNCs），并構建了一種基于FRET的檢測水產品中殘留CV的新方法，實現了CV的簡單快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

結晶紫（2 mmol·L-1）：稱取0.081 6 g CV粉末，用超純水定容于100 mL容量瓶，再轉移至棕色試劑瓶，4 ℃儲存備用；六水合氯金酸（5 mmol·L-1）：稱取HAuCl4·6H2O 0.205 6 g，用超純水定容于100 mL容量瓶，再轉移至棕色試劑瓶4 ℃儲存備用；硝酸銀（5 mmol·L-1）：稱取0.042 4 g AgNO3，用超純水定容于50 mL容量瓶，4 ℃儲存于棕色試劑瓶。實驗所用試劑全部為分析純，實驗用水為超純水，電阻率≥18.25 MΩ·cm。

1.1.2 實驗儀器

Luminous熒光分光光度計，美國賽默飛公司；UV2550紫外可見分光光度計，日本島津公司；Tecnai G2 F20 S-TWIN透射電子顯微鏡，美國FEI公司；Escalab 250Xi X射線光電子能譜儀，美國賽默飛公司；IRTracer-100傅立葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；FLS980熒光光譜儀，英國愛丁堡公司；Nano ZS-90動態光散射納米粒度分析儀，英國馬爾文公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DEW-AuAgNCs的合成

以鴨蛋清、氯金酸和硝酸銀為前體，采用一步微波法在1 min內快速合成DEW-AuAgNCs。取鴨蛋清置于錐形瓶中，磁力攪拌10 min，并超聲20 min充分混勻。向錐形瓶中依次加入1.7 mL的鴨蛋清、2.4 mL的5 mmol·L-1HAuCl4和185 μL的5 mmol·L-1AgNO3溶液，磁力攪拌2 min后，逐滴加入800 μL的1 mol·L-1NaOH溶液，攪拌2 min，放入微波爐中，225 W反應1 min，得到深黃色液體。為去除未反應完的鴨蛋清、HAuCl4和AgNO3，采用50 KD截留量的超濾管4 000 r·min-1離心20 min對DEWAuAgNCs純化處理，棄去濾出液，將濃縮液置于4 ℃避光儲存。同時分別在不添加AgNO3和HAuCl4的條件下采用相同的方法合成DEW-AuNCs和DEW-AgNCs。

1.2.2 TEM表征

分別吸取適量的DEW-AuAgNCs溶液，滴加到銅網上，待完全干燥后，采用透射電鏡觀察DEWAuAgNCs的形貌、分布及粒徑大小。

1.2.3 XPS表征

將載玻片裁成1 cm×1 cm大小的正方形，王水浸泡24 h后用大量超純水清洗。將DEW-AuAgNCs滴加到載玻片上，放入真空干燥箱，待完全干燥后，采用X射線光電子能譜儀分析DEW-AuAgNCs的元素種類[2]。

1.2.4 紅外表征

將鴨蛋清和DEW-AuAgNCs分別進行冷凍干燥處理，得到固體粉末，壓片后上機掃描紅外光譜。

1.2.5 結晶紫檢測體系的建立

依次向pH值為5的NH4Ac-HAc緩沖液中加入50 μL DEW-AuAgNCs和50 μL不同濃度的CV標準溶液，放入恒溫混勻儀中30 ℃反應5 min，上機掃描其熒光光譜。在380 nm激發波長下，記錄682 nm處的熒光強度，并計算熒光猝滅效率（F0-F）/F0（F0和F分別為加入CV前后的熒光強度值）。以（F0-F）/F0為縱坐標，CV的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 實際樣品的檢測

于當地市場購買新鮮鯽魚和草魚，分別取適量魚肉利用組織研磨儀粉碎后，準確稱取5 g，加入13 mL乙腈并超聲30 min，離心取上清液。向沉淀中再加入12 mL乙腈，再次超聲30 min，離心取上清液。合并兩次提取液，放入真空干燥箱揮干乙腈，再加入25 mL超純水后檢測其中的CV含量，并進行加標回收實驗。

2 結果與分析

2.1 DEW-AuAgNCs的形成

以鴨蛋清為保護劑和還原劑，采用一步微波法合成了DEW-AuAgNCs。DEW-AuAgNCs的形成過程可分為3步。①在堿性條件下，HAuCl4和AgNO3可被蛋白質中具有還原性的成分（酪氨酸和半胱氨酸殘基）還原為零價的金和銀。由于AuCl4-的還原電勢低于Ag+，故金的還原速度比銀相對要快，因此被還原的Au原子先沉積形成金核[3]。②Ag+在先形成的金核表面形成金屬鍵，同時金核催化了銀核的沉積。③金核和銀核共沉積從而形成合金核，并在蛋白質模板內部進一步聚集，形成了具有強熒光發射的金銀納米簇。

2.2 DEW-AuAgNCs的表征

采用透射電子顯微鏡觀察了DEW-AuAgNCs的大小和形態。由圖1（a）可以看出DEW-AuAgNCs在水溶液中分散均勻，形狀為近球形，無核殼結構。圖1（b）的粒徑在1.0～2.6 nm，平均尺寸約為1.83 nm。圖1（a）的內插圖為DEW-AuAgNCs在高分辨率透射電鏡下的晶格結構圖，通過Digital Micrograph軟件分析得DEW-AuAgNCs的晶格間距約0.19 nm。

利用傅里葉變換紅外（Fourier Transform Infrared，FT-IR）研究了DEW-AuAgNCs的化學結構和形成機理。圖2是鴨蛋清和DEW-AuAgNCs的FT-IR圖，鴨蛋清和DEW-AuAgNCs的FT-IR光譜具有極為相似的吸收峰。3 298 cm-1處的吸收峰與O–H和N–H的伸縮振動有關，1 531 cm-1處歸因于C-N的特征峰，1 649 cm-1處屬于C=O的振動吸收峰，這證明了酰胺I帶和酰胺II帶的存在；在合成DEW-AuAgNCs前后，酰胺鍵的位置沒有發生明顯的變化，表明所合成的AuAgNCs被包裹在鴨蛋清中。合成DEWAuAgNCs后3 298 cm-1、1 649 cm-1和1 531 cm-1位置的峰強度均變弱，且3 298 cm-1的峰變寬，這表明AuCl4-和Ag+與蛋白質之間發生了相互作用，改變了蛋白質二級結構。

圖2 DEW-AuAgNCs 的紅外光譜圖

2.3 DEW-AuAgNCs檢測CV的原理

本文以廉價的生物質材料鴨蛋清為模板，采用微波法快速（1 min內）合成長波長發射的DEWAuAgNCs。合成的DEW-AuAgNCs在380 nm激發波長下，在682 nm處有最大熒光發射[4]。基于DEW-AuAgNCs與CV之間的FRET，DEWAuAgNCs的熒光被CV選擇性地猝滅，據此本研究構建一種熒光猝滅法檢測水產品中殘留的CV，檢測原理如圖3所示。

圖3 DEW-AuAgNCs的合成和熒光猝滅法檢測CV的原理圖

2.4 熒光猝滅機制的分析

常見的熒光猝滅機制有光誘導電子轉移（Photoinduced Electron Transfer，PET）、靜電相互作用、熒光共振能量轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）和內濾效應（Inner Filter Effect，IFE）。為探索CV猝滅DEW-AuAgNCs熒光的機制，通過紫外可見吸收光譜、熒光光譜、Zeta電位和熒光壽命等一系列表征來系統的驗證。由圖4（a）可以看出，在添加CV標準溶液后，DEW-AuAgNCs的紫外吸收峰位置沒有明顯改變，且未出現新的吸收峰，因此DEW-AuAgNCs和結晶紫反應后沒有產生新的復合物排除PET。由圖4（b）可以看出，DEWAuAgNCs、CV、DEW-AuAgNCs+CV的Zeta電位分別為-18.43 eV、-6.29 eV和-21.5 eV，DEWAuAgNCs和CV均帶負電荷，故二者之間不會發生靜電相互作用。通過掃描DEW-AuAgNCs的激發光譜、發射光譜和CV的紫外可見吸收光譜，由圖4（c）發現，DEW-AuAgNCs的熒光發射光譜和CV的紫外可見吸收光譜有部分重疊，因此，二者之間可能發生了FRET或IFE。

圖4 熒光猝滅機制驗證過程

FRET是當供體熒光分子從激發態向基態躍遷時，釋放的能量被受體分子吸收的能量轉移現象。在FRET的過程中，供體分子本身熒光強度減弱，熒光壽命發生衰減，而受體分子熒光增加或不變。故FRET發生的前提是指供體的發射光譜與受體的紫外可見吸收光譜有重疊；二者的距離足夠近（一般在10 nm內）；供體的熒光壽命發生衰減。IFE是指猝滅劑吸收熒光物質的激發或發射光，從而使熒光物質的熒光被猝滅的現象。在IFE過程中，猝滅劑的紫外可見吸收光譜與熒光物質的激發光譜或發射光譜重疊并且加入猝滅劑前后，熒光物質的熒光壽命不會改變[5]。FRET和IFE的主要區別在于在猝滅劑的存在下，體系的熒光壽命是否發生了變化。因此進一步檢測了單獨的DEW-AuAgNCs和添加CV后的熒光壽命。由圖4（d）可以看出添加CV后體系的熒光壽命發生了明顯的衰減。DEW-AuAgNCs的熒光壽命為405 ns，與結晶紫反應后，體系的熒光壽命衰減到282 ns，熒光壽命衰減了30.37%。以上的結果表明，CV猝滅DEWAuAgNCs熒光的機制是FRET。

2.5 實際樣品分析

作為水產品養殖的殺菌劑，CV易富集在魚類體內，對人體健康造成威脅。為進一步驗證該方法的實用性，對草魚和鯽魚中CV的含量進行了檢測，并做了加標回收試驗。如表1所示，草魚和鯽魚中未檢測到CV，向樣品溶液中加入0.05 μmol·L-1、0.50 μmol·L-1和1.00 μmol·L-13個濃度的CV標準溶液，7次平行測定結果顯示，加標回收率在98.00%～104.90%。因此，本研究構建的DEW-AuAgNCs熒光探針用于檢測魚類樣本中的CV具有準確性和可靠性。

表1 魚類樣品中CV的檢測結果表（n=7）

3 結論

基于FRET的傳感方法具有快速和靈敏度高等優點，在藥物、食品和環境檢測領域有廣闊的應用前景。新型納米材料，如碳點、金屬納米簇、金屬納米粒子、上轉換納米粒子和二維層狀納米片具有優異的光學性質和生物相容性，是FRET體系熒光供體和受體的理想材料。此外核酸適配體和抗體等具有高度特異性，可利用這個特性大大提高傳感方法的靈敏度。