UPLC-MS/MS法測定鯽魚中呋喃唑酮代謝物的不確定度評估

黎英權(quán)，朱偉霞

（廣東宏科檢測技術(shù)有限公司，廣東惠州 516100）

呋喃唑酮（Furazolidone，AOZ）能抑制大多數(shù)的病毒和真菌生長，且價格便宜，所以水產(chǎn)養(yǎng)殖戶們通常用其治療一些由病菌引發(fā)的疾病[1-3]。然而，該藥物有致癌風(fēng)險，并會在食用動物體內(nèi)長期殘留，因此成了一種禁用獸藥[4]。為確保超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定AOZ殘留量的準(zhǔn)確性，檢測實驗室應(yīng)根據(jù)JJF 1059.1—2012[5]、RB/T 214—2017[6]、CNAS—CL01：2018[7]等規(guī)定對測定過程開展不確定度評價。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)品：3-氨基-2-惡唑酮（AOZ，純度99.32%、3-氨基-2-惡唑酮的內(nèi)標(biāo)物（AOZ-D4，純度99.0%），德國Dr公司。

TRIPLE QUAD 4500液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX；FSJ-A03E1組織搗碎機，小熊電器；T25 easy clean digital均質(zhì)器，德國IKA；3K15離心機，德國SIGMA；HGC-12A氮吹儀，天津恒奧科技；PX223ZH/E分析天平，奧豪斯儀器（常州）；移液器，德國BRAND；THZ-82恒溫水浴搖床，國華（常州）儀器。

1.2 檢測方法

鯽魚樣品按照《動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 21311—2007）進行預(yù)處理，使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra-High Performance Liquid Chromatography And Mass Spectrometry，UPLCMS/MS）檢測。

1.3 呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制

AOZ標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 017 μg·mL-1）：準(zhǔn)確稱取0.025 60 g AOZ于25 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容；AOZ標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.017 μg·mL-1）：用移液槍準(zhǔn)確吸取AOZ標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.10 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容；AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)儲備液（132 μg·mL-1）：準(zhǔn)確稱取0.001 32 g AOZ-D4于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容；AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.32 μg·mL-1）：用移液槍準(zhǔn)確吸取AOZ-D4標(biāo)準(zhǔn)中間液1.0 mL至100 mL容量瓶中，乙腈定容；AOZ標(biāo)準(zhǔn)使用液：按照標(biāo)準(zhǔn)操作要求，配制基質(zhì)標(biāo)曲，最終AOZ標(biāo)準(zhǔn)使用液的濃度點分別為1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和100.0 ng·mL-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

UPLC-MS/MS法測定試樣中AOZ殘留量采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，定量結(jié)果按公式（1）計算。

式中：X為鯽魚中呋喃唑酮代謝物的含量，μg·kg-1；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的供試品溶液中呋喃唑酮代謝物的濃度，ng·mL-1；V為最終定容體積，mL；m為稱取鯽魚的質(zhì)量，g。

2.2 不確定度來源分析

UPLC-MS/MS法測定鯽魚中AOZ殘留量的不確定度主要來源為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量和定容、鯽魚樣品的稱取、樣品重復(fù)測定、標(biāo)準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)。

2.3 不確定度評定

2.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,1(S)

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,2(P)。查呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可得其擴展不確定度為1.73%（k=2），純度為99.32%，算得相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

（2）稱量呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,3(m)。根據(jù)電子天平檢定證書，最大允許誤差（Maximum Permissible Errors，MPE）為±0.05 mg，按矩形分布（）計算，稱取呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.025 60 g，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

（3）使用移液槍和玻璃量具配制目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲備液產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,4(V1)。依據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[8]得，A級25 mL和50 mL容量瓶的最大容量允差分別為±0.03 mL和±0.05 mL，用到200 μL移液槍的最大容量允差為±3.0 μL，按三角分布（）計算定容產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

配制中間液，使用200 μL的移液槍，取50 μL儲備液，乙腈定容至50 mL容量瓶，按照三角分布，該過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

使用移液槍和玻璃量具產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

（4）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中所用器量具引起的不確定度urel,8(V2)。由移液槍校準(zhǔn)證書和《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[8]可知移液器、A級容量瓶的最大容量允差，按三角分布（）計算，可得使用移液槍、容量瓶引起的相對不確定度的平方（表1）。

表1 使用容量瓶引起的相對不確定度

移取10 μL AOZ-D4引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中所用器量引起的不確定度平方為

綜上，可得配制標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

2.3.2 鯽魚樣品預(yù)處理過程中引入的相對不確定度urel,10(Q)

（1）使用電子天平稱取鯽魚樣品產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,11(m)。由電子天平檢定證書可知，該電子天平的稱樣量在0～50 000 mg時，最大允差為0.5 mg，因此當(dāng)樣品取樣量為2.000 g時，由電子天平稱量產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方為

（2）樣品處理過程中所用量器引入不確定度urel,12(V3)。最終定容時，使用1 000 μL移液槍，其最大允差為±10.0 μL，按三角分布考慮（），移取1 000 μL樣品溶液進行定容，得到所用量器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

移取10 μL內(nèi)標(biāo)溶液到樣品中，使用的20 μL移液槍根據(jù)其檢定證書可知最大允差為±0.8 μL，故其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

樣品預(yù)處理過程中涉及量器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

綜上，檢測鯽魚樣品中呋喃唑酮代謝物預(yù)處理過程中產(chǎn)生的相對不確定度的平方為

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及樣品重復(fù)測定產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,15(C)

（1）鯽魚樣品重復(fù)測定引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(X)。在相同條件下，對一份陽性的樣品進行6次重復(fù)測定，數(shù)據(jù)見表2。計算陽性樣品中呋喃唑酮代謝物重復(fù)性測定引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

表2 樣品重復(fù)性測定結(jié)果

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)偏差引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,16(Y)。對呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)使用液的每個標(biāo)準(zhǔn)點都測定3次,以校正點濃度為橫坐標(biāo)，呋喃唑酮代謝物峰面積響應(yīng)值與呋喃唑酮代謝物內(nèi)標(biāo)峰面積響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)，通過最小二乘法得到相關(guān)系數(shù)及一元回歸方程，所得數(shù)據(jù)見表3。計算可得，目標(biāo)化合物線性回歸方程為y=1.121 7x+0.090 7；相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。根據(jù)貝塞爾公式，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)偏差（峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差）引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

表3 3次測定的結(jié)果

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

2.4 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜合以上標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程、鯽魚樣品預(yù)處理過程、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及樣品重復(fù)測定過程引入的相對不確定度，可計算合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 擴展不確定度

置信區(qū)間為95%時，包含因子k=2，相對擴展不確定度為Urel=2×0.032 8=6.56%；樣品AOZ檢出值為9.605 μg·kg-1，其擴展不確定度為U=9.605×6.56%=0.630 μg·kg-1。

3 結(jié)論

本文采用UPLC-MS/MS法檢測鯽魚中的AOZ，實驗數(shù)據(jù)表明，當(dāng)置信區(qū)間為95%時，包含因子k=2，所測鯽魚中AOZ含量為9.605 μg·kg-1，擴展不確定度U為0.630 μg·kg-1。適當(dāng)增加樣品平行測定的次數(shù)和選用精度較高的量器都能很大程度地降低結(jié)果的不確定度，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。