改進HPLC-ICP-MS法測定食品中的無機砷

劉立秋

（中國檢驗認證集團上海有限公司，上海 201201）

砷存在多種形態，其毒性與存在形態密切相關，不同形態的砷對人體作用差別很大[1]。食品中砷的常見形態為砷甜菜堿（Arsenic Betaine，AsB）、二甲基砷（Dimethyl Arsenic，DMA）、一甲基砷（Monomethyl Arsenic，MMA）、五價無機砷（AsⅤ）、三價無機砷（AsⅢ）。無機砷的毒性大于有機砷，而無機砷中AsⅢ的毒性又遠遠大于AsⅤ[2-3]，甲基化的砷毒性較小，而AsB被認為是無毒的，其毒性從大到小依次為AsⅢ＞AsⅤ＞MMA＞DMA＞AsB[4]。不同種類的食品中砷形態組成差別較大，總砷含量較大的食品可能無機砷的含量很小，因此進行砷的形態分析比單純用砷的總量評價食品安全性更具科學性。目前，高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）是《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》（GB 5009.11—2014）[5]規定的測定食品中無機砷的方法，但在實際工作中參照國標規定的方法條件測定食品中的無機砷具有一定局限性，無法完全分離DMA和AsⅢ的色譜峰，會出現無機砷檢測值偏高或假陽性結果。本研究通過改變流動相組成及洗脫程序優化了HPLC-ICP-MS方法，能使DMA和AsⅢ色譜峰完全分離開，不同種形態砷的色譜峰分離度得到了提高。為進一步驗證該改進方法測定食品中無機砷的可靠性，采用無機砷空白米粉作為樣品基質，對其無機砷的檢出限進行測定，并進行精密度和回收率分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260液相色譜-Agilent 7700X電感耦合等離子體質譜聯用儀（安捷倫科技有限公司）；CEM MARS 2微波消解儀（美國CEM公司）；飛鴿GL-20G-II高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）。

砷甜菜堿、二甲基砷、一甲基砷標準溶液（中國計量科學研究院）；AsⅤ、AsⅢ標準溶液（o2si公司）；氬、氦，均為99.999%；超純水（電阻率達到18.25 MΩ·cm）；無水乙酸鈉、磷酸二氫鈉、硝酸鉀、乙二胺四乙酸二鈉、碳酸銨、氨水、乙酸和無水乙醇，均為優級純；儀器調諧液：濃度各為1 μg·L-1的Li、Y、Ce、Tl、Co混合溶液。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取已制備好的米粉1.0 g（準確至0.001 g），置50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL 0.15 mol·L-1HNO3溶液，放置過夜。置90 ℃恒溫箱中熱浸提2.5 h，每0.5 h振搖1 min。提取完畢，取出冷卻至室溫，8 000 r·min-1離心15 min，取上層清液，經0.45 μm有機濾膜后進樣測定，同時做空白試驗。

1.2.2 儀器工作條件

（1）液相色譜工作條件。①GB 5009.11—2014標準提供的液相色譜工作條件。流動相C為10 mmol·L-1無水乙酸鈉+3 mmol·L-1硝酸鉀+10 mmol·L-1磷酸二氫鈉+0.2 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉緩沖液+1%乙醇，用氨水調節pH＝10.0；色譜柱為HAMILTON PRP-X100 10 μm COL 250 mm×4.1 mm；流動相流速為1.0 mL·min-1，進樣體積為20 μL，洗脫方式為等度洗脫。②本研究改進后的液相色譜工作條件。流動相A為0.1 moL·L-1碳酸銨+2%甲醇，用氨水或乙酸調pH值，使pH=8.8～9.0；流動相B為2%甲醇水溶液；色譜柱為HAMILTON PRP-X100 10 μm COL 250 mm×4.1 mm（與改進前的實驗使用同一根色譜柱）；流動相流速為1.0 mL·min-1，進樣體積為20 μL，洗脫方式為梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

（2）ICP-MS工作條件。射頻功率為1 500 W，等離子體氣流量為15 L·min-1，霧化器流量為1.00 L·min-1，氦氣流量為（碰撞池）4.5 mL·min-1，霧化室溫度為2 ℃。

2 結果與分析

2.1 實驗條件改進結果

圖1為使用GB 5009.11—2014標準的流動相和洗脫程序形成的色譜圖，圖2為使用改進后的流動相和洗脫程序形成的色譜圖，兩色譜圖的進樣溶液（AsB、DMA、MMA、AsⅤ和AsⅢ）濃度均為50 μg·L-1。從圖1、圖2可以看出，使用GB 5009.11—2014標準的流動相和洗脫程序形成的色譜圖中，DMA和AsⅢ色譜峰重疊在一起，而使用改進后的流動相和洗脫程序形成的色譜圖分離度很好，能把DMA和AsⅢ色譜峰完全分離開。

圖1 GB 5009.11—2014標準方法的色譜圖

圖2 改進方法的色譜圖

通常，色譜柱使用時間越長，柱效會越差，不同批次的同一類色譜柱，柱效也不一樣，當色譜柱柱效不能滿足實驗的分離度時，可以通過改變洗脫程序中流動相的比例來調整和優化。流動相中碳酸銨的濃度越高，各組分的保留時間越短，因此可以通過調節流動相中碳酸銨的比例來調節各組分的保留時間和分離度。實驗過程中分離度不好時，適當增加流動相B的比例，可以提高各色譜峰的分離度，以滿足檢測要求。

2.2 方法的線性考察

取適量的AsⅤ和AsⅢ標準溶液，用超純水制備成濃度為2.5 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1和100.0 μg·L-1的系列標準溶液，使用改進后的HPLC-ICP-MS方法檢測，得到標準曲線回歸線方程。AsⅢ：y=8 029.912 821x，相關系數R=0.999 3；AsⅤ：y=12 993.529 5x+6 024，相關系數R=0.999 3。由此可知，在2.5～100.0 μg·L-1，該方法的線性相關性很好。

2.3 方法檢出限的測定

稱量空白米粉7份，每份1.0 g，在7份空白米粉中各加入10 μL 1 000 μg·L-1的AsⅢ和AsⅢ混合標準溶，按1.3.1進行處理，采用流動相改進的HPLCICP-MS方法測定。根據3倍信噪比確定檢出限，檢出限=3X/（S/N），其中X=10×1 000/1.0=0.01 mg·kg-1，米粉AsⅢ檢出限為0.002 8 mg·kg-1，米粉AsⅤ檢出限為0.003 2 mg·kg-1，而GB 5009.11—2014標準中米粉的檢出限為0.01 mg·kg-1，可見流動相改進后的方法檢出限更低。AsⅢ、AsⅤ檢出限測定結果見表2。

表2 檢出限測定結果

2.4 方法精密度與回收率的測定

稱量空白米粉22份，每份1.0 g，1份空白米粉不加標，其余21份空白米粉分3組7平行分別加入1 000 μg·L-1的標準混合溶液50 μL、100 μL、500 μL，按1.3.1進行處理，采用改進的HPLC-ICPMS法測定精密度與回收率，結果見表3。方法回收率為92.4%～95.4%，精密度（RSD）為1.41%～2.70%，符合相關標準要求。

表3 精密度與回收率測定結果（n=7）

3 結論

砷的毒性與其形態密切相關，無機砷有劇毒，有機砷則幾乎無毒，砷的形態分析對于食品安全的研究具有重大意義。按照GB 5009.11—2014規定的流動相及洗脫程序測定食品中的無機砷，會出現DMA和AsⅢ色譜峰重疊，致使無法準確測定食品中無機砷的含量，因此本研究對該方法的流動相和洗脫方式進行了改進。使用改進后的HPLC-ICP-MS法測定食品中的無機砷，各峰分離度高，能把DMA和AsⅢ完全分離開來，提高了無機砷檢測的準確性。相對于國標方法，改進后的流動相組成簡單且不含鈉鹽，對色譜柱損害小，靈敏度更高。本研究采用米粉作為樣品基質，對該方法的線性、檢出限、精密度和回收率進行了考察，結果顯示，在無機砷濃度為2.5～100.0 μg·L-1時，該方法的線性相關性很好，檢出限比改進前低很多，精密度和回收率良好。