芒果中農藥殘留膠體金免疫層析快速檢測方法的建立與應用

韋 盈，李 川，符郁馥，林志藩，郭曉宇，康 蕊*

（1.海南省食品檢驗檢測中心，海南?？?570314；2.國家市場監管重點實驗室（熱帶果蔬質量與安全），海南?？?570314；3.海南大學 食品科學與工程學院，海南?？?570228）

芒果，系多年生熱帶、亞熱帶水果，是僅次于香蕉的世界第二大熱帶水果[1]。芒果果實含有豐富的糖、維生素、蛋白質、粗纖維和微量元素，其果肉細膩可口，營養物質豐富，深受人們喜愛[2]。我國芒果主要產區分布于海南、廣西、云南、廣東、四川、福建和臺灣等省區[3-4]。目前芒果產業已經成為我國熱帶和亞熱帶地區支柱產業之一，在推進農業結構優化調整、農民增收、擴大出口和滿足人們的生活需求等方面發揮著重要作用。

果蔬中農藥殘留超標是消費者最關注的食品安全問題。馬晨等[5]對海南芒果中農藥殘留情況進行了分析，發現芒果中不合格率較高的農藥殘留分別是吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺，不合格率分別為21.91%、19.1%、2.81%。目前農藥的檢測方法主要是實驗室儀器法，該方法不僅需要高精端儀器和專業人員，而且操作復雜，檢測時間長，很難控制在銷售期內完成檢驗，無法有效保證食品安全。因此，利用快速檢測技術對市場上芒果進行農藥殘留檢測很有必要。

農藥殘留常見的快速檢測方法是酶抑制率法和拉曼光譜法。酶抑制率法主要用于檢測有機磷和氨基甲酸酯類農藥，由于酶易受色素、植物次生物質影響，其適用的種類有限，準確度也不夠高[6]。拉曼光譜法因需要建立數據庫，且選擇的基底有限，不能被廣泛應用。膠體金免疫層析技術是一種以膠體金作為示蹤標志物，抗原抗體特異性競爭的新型檢測技術。由于其具備快速、操作簡單、成本低、無需貴重設備等優點，被廣泛應用于各檢測領域。隨著各種農藥抗體的成功制備，近幾年該技術越來越多地被運用到農藥殘留檢測中[7]。膠體金免疫層析技術與酶抑制率法相比，具有靈敏度高、抗干擾能力強等特點，可用于單一種類農藥殘留的檢測分析。

吡唑醚菌酯、噻蟲胺、吡蟲啉是芒果中風險較高的項目，目前沒有同時檢測這幾種農藥殘留的快速檢測方法，芒果基質的適用性也缺少相應研究。本研究旨在對膠體金免疫層析法同時檢測芒果中吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺的快速檢測技術開展應用研究，以期為芒果質量安全監管和生產者安全自檢工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芒果來源于海南省海口市、東方市、昌江縣果園、農貿市場和超市；吡唑醚菌酯殘留檢測試紙條、噻蟲胺殘留檢測試紙條、吡蟲啉殘留檢測試紙條和提取液，中檢國研（北京）科技有限公司；檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸鈉二鈉鹽倍半水合物、氯化鈉和無水硫酸鎂（分析純），廣州化學試劑廠；甲酸（色譜級），甲醇、乙腈（質譜級），默克公司；實驗室用水由miili-Q A10超純水機制備。

對照品：吡唑醚菌酯、噻蟲胺、吡蟲啉、苯醚甲環唑、滅蠅胺、啶蟲脒、丙溴磷、毒死蜱和克百威，純度為99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

TQ-S超高效液相-質譜串聯儀，美國沃特世公司；XS205、XS204分析天平，美國梅特勒公司；Centrifuge 5804離心機，德國艾本德股份公司；MS3微量振蕩器，德國IKA公司；10 μL、200 μL、1 mL、5 mL移液槍，德國BRAND公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗原理

本方法采用膠體金免疫層析原理。樣品中的吡唑醚菌酯、噻蟲胺、吡蟲啉等農藥經提取后與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上抗原的結合，從而產生檢測線顏色深淺的變化[8]。通過比較檢測線（T線）與控制線（C線）顏色變化，對樣品中吡唑醚菌酯、噻蟲胺、吡蟲啉進行定性判定。

1.3.2 實驗方法

取新鮮芒果擦去泥土，剪碎成小于1 cm見方的碎片。稱?。?.00±0.05）g樣品至15 mL離心管中，再加入5 mL提取液，蓋上蓋子，渦旋儀渦動或手動上下振蕩1 min，靜置2 min，得樣品液。從原包裝袋中取出試紙條。用一次性微型吸管吸取樣品提取液，垂直緩慢滴加3滴（約100 μL）于加樣孔（S孔）中。滴加后立即計時，10 min后，判定結果。

1.3.3 結果判定

本方法采用目測方式，通過比較檢測線（T線）與控制線（C線）顏色，定性判定樣品中是否含有待測物。如圖1所示，T線與C線顯色相同或T線顯色深于C線，表示樣品中未檢出待測物或待測物濃度低于檢測限，判為陰性（-）；T線顯色淺于C線，或者T線消失，表示樣品中有待測物檢出，判為陽性（+）；C線不顯色，表示試紙條已失效或前處理操作不正確，判為無效[8]。

圖1 結果判定示意圖（比色法）

1.3.4 評價方法

每個項目取芒果空白基質60份，設置空白樣品、檢出限1倍、檢出限2倍3個濃度水平，每個濃度水平20例進行驗證評價，對建立的快速檢測方法進行靈敏度、特異性、假陰性率、假陽性率以及與參比方法一致性的分析，評價方法的靈敏度和準確度。

1.3.5 交叉反應實驗

取芒果空白樣品18份，分為3組，使用苯醚甲環唑、丙溴磷、滅蠅胺、毒死蜱、啶蟲脒和克百威有證標準物質進行加標，使每組每個樣品的干擾物濃度分別為5 mg·kg-1，吡唑醚菌酯殘留檢測試紙條、噻蟲胺殘留檢測試紙條、吡蟲啉殘留檢測試紙條各測試一組樣品。

2 結果與分析

2.1 制樣方式優化

取新鮮芒果分成2份，一份剪碎成小于1 cm見方的碎片，另一份用組織搗碎機勻漿，稱取2 g樣品進行實驗。制樣方式不同，膠體金卡呈現的顯色效果不同。芒果被均質后樣品內容物釋放，對顯色造成一定的干擾，不利于結果的判定，且試驗過程中容易堵塞加樣孔。故本研究采用剪碎成小于1 cm見方的碎片為制樣方式。

2.2 提取時間優化

設置提取時間為1 min、2 min、5 min、10 min、30 min、60 min和120 min，稱取2 g樣品進行實驗。結果表明，提取時間對陰性樣品幾乎無影響；對于陽性樣品，提取時間為1 min、2 min、5 min、10 min和30 min時，目標物均可被很好地提取，30 min后隨著提取時間增加，受環境影響目標物有所降解，陽性變弱。綜合考慮樣品提取時間以2～5 min為最佳，超過30 min未測定應重新取樣進行處理。

2.3 免疫反應時間優化

設置免疫反應時間為1 min、2 min、5 min、8 min、10 min、15 min和30 min，稱取2 g樣品進行實驗。免疫反應2 min時，樣品可從樣品孔沿NC膜（硝酸纖維素膜）層析至試紙條頂端，此時T線、C線初步顯色，但顯色不明顯；2～5 min時，T線、C線繼續增強，5 min時可以判讀結果；5～8 min時，T線、C線顯色繼續增強，變化速度有所減慢；8～10 min時，T線、C線顏色不再增強。綜合考慮，免疫反應時間以10 min為最佳。

2.4 檢出限

《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中規定吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺在芒果中的最大殘留限量分別為0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1，故本快檢方法設置吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺檢出限分別為0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1。取芒果基質空白試樣，分別添加一系列吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺標準溶液，并進行測定。結果顯示，在未稀釋的情況下吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺檢出濃度水平分別為0.050 mg·kg-1、0.100 mg·kg-1、0.005 mg·kg-1，與設置的檢出限0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1相比，吡唑醚菌酯無需稀釋，可直接測定；吡蟲啉、噻蟲胺試紙條較靈敏，需稀釋后測定，稀釋倍數分別為2和8。

2.5 評價結果

根據樣品制備信息和快篩檢測結果，3個項目評價結果如下。①吡蟲啉、噻蟲胺兩個項目假陰性率、假陽性率均為0%，靈敏度、特異性、相對準確度均為100%，表明該方法在設置的檢出限處檢得出、檢得準。②吡唑醚菌酯40個陽性樣品中被檢出2個陰性結果，且2個陰性結果均出現在1倍檢出限樣品中，其靈敏度、特異性、假陰性率、假陽性率、相對準確度分別為95%、100%、5%、0%、96.7%，說明吡唑醚菌酯與吡蟲啉、噻蟲胺相比靈敏度還需進一步提高。③3個項目均滿足靈敏度≥95%、特異性≥85%、假陰性率≤5%、假陽性率≤15%的要求，建立的快速檢測方法具有一定的可行性。

2.6 交叉實驗

使用本方法檢測含有5 mg·kg-1苯醚甲環唑、丙溴磷、滅蠅胺、毒死蜱、啶蟲脒和克百威的樣品，結果如表1。吡唑醚菌酯檢測試紙條、吡蟲啉檢測試紙條、噻蟲胺檢測試紙條對其他農藥均呈現陰性，方法特異性好。

表1 交叉反應實驗結果

2.7 樣品測試及一致性分析

從市場上采集40份芒果樣品，同時按照參比方法《食品安全國家標準 植物性食品中331種農藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯用法》（GB 23200.121—2021）和本研究所建立的快檢方法對樣品進行測試，比對數據見表2。膠體金試紙條檢出噻蟲胺4批陽性，分別為澳芒1批次、貴妃芒2批次、蘋果芒1批次；吡唑醚菌酯1批次陽性，為雞蛋芒；吡蟲啉未檢出陽性。膠體金試紙條檢測結果與參比方法檢測結果符合率為100%，建立的快檢方法準確度較高。

3 結論

本研究基于膠體金免疫層析技術原理，針對芒果中風險較高的吡唑醚菌酯、噻蟲胺、吡蟲啉3種農藥殘留建立了一種同時檢測的快速檢測方法。該方法吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺檢出限分別為0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1，符合國家標準的要求，且操作簡單，準確度高，成本低，適合缺乏實驗條件的農貿市場、進出口港口對大量樣本進行快速篩查，大大提高芒果的檢測效率以及發現問題的能力，為食品安全的科學監管提供了有力的技術支撐。