抗病毒治療慢性乙型肝炎患者血清外泌體HBV-miR-3動態變化與病毒學指標的關系

鐘劍秋 徐燕 徐敏

慢性乙型肝炎(CHB)可進展為肝纖維化、肝硬化,甚至肝癌,而抗病毒治療是控制CHB向肝硬化和肝癌發展的重要措施[1-3]。核苷(酸)類似物是CHB防治指南推薦的抗HBV的一線藥物,可競爭性抑制HBV DNA聚合酶的活性,抑制HBV DNA復制,抗病毒作用強,安全性好,但早期應答率低,療程長[4-5]。研究發現,HBV可編碼HBV相關microRNA,其被命名為HBV-miR-3,可作為HBV 共價閉合環狀DNA(cccDNA)檢測的替代標志物[6]。本研究探討CHB患者抗病毒治療前后血清外泌體HBV-miR-3動態變化與病毒學指標的關系,分析HBV-miR-3是否可用于預測抗病毒療效。

資料與方法

一、一般資料

選取2020年6月至2021年6月收治的116例CHB患者,均接受替諾福韋(TDF,福建廣生堂藥業股份有限公司)治療,300 mg/次,1次/d,隨餐服用,共12個月。

納入標準:CHB診斷符合文獻[7]標準;年齡>18歲;接受TDF單藥初治12個月。排除標準:其他嗜肝性病毒感染;合并其他慢性肝病;已出現明顯肝纖維化、肝硬化或者肝癌;合并其他嚴重肝臟疾病、內科疾病或者惡性腫瘤。

二、監測指標

一般資料包括性別和年齡。治療前及治療后3、6、9和12個月,采集靜脈血10 mL,采用全自動生化分析儀檢測ALT;電化學發光法(ARCHITECTi2000檢測儀)檢測HBsAg定量;PCR檢測HBV DNA。

三、外泌體HBV-miR-3檢測

采用干燥管留取全血2 mL,以1500 r/min離心5 min,取上清液,轉移至1.50mL離心管備用。按外泌體提取試劑盒(上海貝博生物科技公司)說明提取血清外泌體,采用Trizol試劑(上海貝博生物科技公司)提取總RNA,參照反轉錄試劑盒(上海貝博生物科技公司)說明將總RNA反轉錄為cDNA,熒光定量PCR試劑盒(上海貝博生物科技公司)進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測,以miR-21作為內參,RT-PCR引 物:miR-3:5′-CGCGAGCACAGAATTA-ATACGACTCACTATACGCGAAACGCCGCA-3′,下游引物 5′-CGCGAGCACAGAATTAATACG-3′,miR-21:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG-GTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3′。采用qRT-PCR進行全定量檢測:miR-3引物序列:上 游 引 物5′-TGTGCCCGCTGGATCTGTC-3′,下游引物 5′-CGCGAGCACAGAATTAATACG-3′,Taqman探針:FAM-CTCACTATACGCGAAACG-MGB;miR-21引物序列:上游引物 5′-GCCCGCTAGCTTATC-AGACTGATG-3′,下游引物 5′-GTGCAGGGTC-CGAGGT-3′,Taqman探針:FAM-CTGGATACG-ACTCAACA-MGB。采用羅氏 LightCycler480 II 實時熒光定量PCR分析熒光信號并檢測絕對定量。

四、統計學分析

使用SPSS 25.0軟件進行統計分析。根據資料類型進行t檢驗或卡方檢驗;Pearson相關分析外泌體HBV-miR-3水平與病毒學指標的關系;受試者工作特征曲線分析外泌體HBV-miR-3水平對病毒學應答的預測效能。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、VR+組和VR-組一般資料比較

抗病毒治療12個月后,發生病毒學應答(VR+組)54例(46.55%),未發生病毒學應答(VR-組)62例。VR+組和VR-組性別和年齡比較差異無統計學意義(P>0.05),VR+組ALT水平高于VR-組,而HBsAg、HBV DNA和外泌體HBV-miR-3水平低于VR-組(P<0.05),見表1。

表1 VR+組與VR-組一般資料比較(±s)

二、VR+組和VR-組接受抗病毒治療前后病毒學指標和外泌體HBV-miR-3的動態變化

接受抗病毒治療后,VR+組和VR-組ALT水平均快速下降,VR+組基線ALT水平高于VR-組,治療3個月后下降至與VR-組水平相當,且一直維持到治療結束;VR+組HBsAg、HBV DNA和外泌體HBV-miR-3水平在抗病毒治療后明顯下降,而VR-組雖有下降但變化不明顯,且一直高于VR+組(P<0.05),見表2。

表2 VR+組和VR-組接受抗病毒治療前后病毒學指標和外泌體HBV-miR-3的動態變化(±s)

三、血清外泌體HBV-miR-3水平與病毒學指標的關系

血清外泌體HBV-miR-3水平與ALT無明顯相關性(r=0.049,P=0.241),與HBV DNA和HBsAg呈正相關(r=0.314、0.809,P<0.05)。

四、血清外泌體HBV-miR-3水平對病毒學應答的預測效能

治療3個月時,外泌體HBV-miR-3以4.52 lg拷貝/mL為最佳界值的AUC最大,敏感度和特異度最高,見表3。

表3 抗病毒治療各時間點外泌體HBV-miR-3水平對病毒學應答的預測效能

討 論

感染HBV后,體內HBV經肝細胞膜進入細胞核,并以cccDNA作為HBV復制的模板,其具有半衰期長、可自我補充的特點,且難以徹底將HBV從體內清除,目前尚缺乏簡單易行的cccDNA定量檢測方法[8]。HBV感染會引起機體的免疫應答反應,造成肝細胞損傷及炎癥壞死,且炎癥壞死的持續存在可增加CHB患者肝硬化、肝癌的發生風險。數據顯示,未抗病毒治療的CHB肝硬化年發生率達2%～6%,而肝硬化患者肝癌的年發生率亦達3%～6%[9,10]。據報道TDF存在早期應答率低的問題[11]。HBV DNA是判斷抗病毒治療應答最常用的指標,但其下降僅代表HBV復制減少;而ALT、HBsAg、HBeAg、乙型肝炎核心相關抗原(HBcrAg)和HBV前基因組RNA(pgRNA)等尚不能準確反映機體對HBV的免疫控制程度,也無法代替肝組織cccDNA檢測[12,13]。

HBV-miR-3主要由感染了HBV的肝細胞分泌,與肝炎恢復期相比,HBV-miR-3相對定量在肝炎活動期異常升高[14]。本研究結果顯示,VR+組HBV-miR-3水平低于VR-組,且CHB患者接受抗病毒治療后,VR+組HBV-miR-3水平隨療程的延長而逐漸降低,提示基線HBV-miR-3水平較低的CHB患者更可能在抗病毒治療后達到病毒學應答的目標,動態檢測HBV-miR-3水平可輔助判斷治療的應答情況,指導后續治療。

研究證實,HBV-miR-3水平能夠在一定程度上作為HBV cccDNA檢測的替代標志物,且與血清HBV DNA水平存在正相關[15]。本研究顯示,VR+組HBsAg、HBV DNA和外泌體HBV-miR-3水平在接受抗病毒治療后明顯下降,且HBV-miR-3水平與HBV DNA和HBsAg呈正相關。原因可能是:以cccDNA為模板能夠合成3.5、2.4、2.1 kb mRNA,進一步以mRNA為模板合成HBV-miR,因此HBV-miR-3能夠一定程度上代表cccDNA的數量,而隨著抗病毒治療,HBV DNA復制被抑制,cccDNA逐漸從肝細胞中清除,故HBV-miR-3水平逐漸下降,而HBV DNA和HBsAg亦逐漸降低,因此HBV-miR-3與二者間存在顯著正相關性。此外,治療3個月時,外泌體HBV-miR-3以4.52 lg拷貝/mL為最佳界值的AUC最大,敏感度和特異度最高。提示HBV-miR-3水平可早期預測抗病毒治療的效果。

綜上所述,CHB患者血清外泌體HBV-miR-3水平隨著抗病毒治療時間的延長而下降,與病毒學指標HBV DNA和HBsAg呈正相關,且抗病毒治療3個月時HBV-miR-3的臨界值可作為預測CHB患者抗病毒治療12個月的病毒學應答的指標。但鑒于本研究樣本量較少,且未進行長時間的隨訪,今后仍需擴大樣本和延長觀察時間進一步驗證。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。