灸預處理對乙醇誘導胃黏膜損傷大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白的影響

霍新慧,周知然,蘭永利,韋 芳,阿斯卡爾·牙生

(1.新疆醫科大學中醫學院,新疆 烏魯木齊 830001;2.新疆維吾爾自治區中醫醫院,新疆 烏魯木齊 830001)

胃黏膜損傷的致病因素有很多,較為常見的是過度或長期飲酒導致的急性損傷。損傷過程中存在大量炎癥細胞和炎癥因子,一般而言,炎癥反應是人體對抗損傷性刺激的一種自我防御,但是伴隨著炎癥反應的級聯反應,機體無法繼續維持穩態的正性調控狀態時,則會導致疾病的發生發展[1]。

《黃帝內經》最早提出了“治未病”思想,孫思邈在《備急千金要方》中首次將灸法與“治未病”理論結合。艾灸作為“治未病”的有效手段,得到廣泛應用。研究[4]表明,針灸防治慢性胃炎的機制主要是去除感染因素、調整胃腸激素、增強機體免疫、增加胃黏膜血流量、提高防御能力以及抑制腺體萎縮與增生。本課題組前期研究[5]證實,灸預處理可減輕大鼠急性胃黏膜損傷,增強胃黏膜微循環屏障,與針刺預處理比較,灸預處理的效果更佳[6]。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是炎癥反應啟動的重要環節[7]。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是TLRs受體信號轉導途徑中的關鍵接頭分子。在TLR4信號通路中,核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)處于樞紐位置,可激發胃黏膜相關炎癥反應[8],影響胃黏膜損傷程度,介導炎癥因子釋放,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等[9]。

因此,本研究通過檢測胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平,探討灸法預處理對胃黏膜的保護機制,從而為臨床預防以胃黏膜損傷為病理基礎的消化系統疾病提供理論基礎。

1 材料

1.1 動物 30只清潔級SD大鼠,雌雄各半,6周齡,體質量(180±20)g,由新疆醫科大學動物實驗中心提供,動物生產許可證號: SCXK(新)2018-0003。飼養于新疆醫科大學動物實驗中心,溫度 20～25 ℃,濕度 50%～54%,自然照明,自由攝食攝水,適應性飼養1周。本研究經過新疆醫科大學動物倫理委員會審批,倫理審批號: IACUC-20230227-3。

1.2 藥物與試劑 大鼠TNF-α ELISA試劑盒(批號202205)、大鼠IL-6 ELISA試劑盒(批號YX-E21122):上海優選生物科技有限公司;TLR4抗體(批號AF7017)、MyD88抗體(批號bs-1047R)、NF-κB p65抗體(批號 AF0874):江蘇親科生物;兔抗TLR4熒光抗體(批號YT0744)、兔抗MyD88熒光抗體(批號YT2928)、鼠抗NF-κB熒光抗體(批號Ym3111):美國Immunoway公司。

1.3 儀器 特制香煙型純艾條(4 mm×120 mm):南陽臥龍漢醫艾絨廠;非接觸式紅外額溫計(型號IM-9001):江蘇魚躍醫療設備股份有限公司;光學顯微鏡(型號 BX51T-PHD-J11):日本奧林巴斯;多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(型號Image-Pro Plus):美國Media Cybernetics公司;酶標分析儀(型號Infinite F50):上海生物科技有限公司;蛋白印跡儀(型號Yrdimes SW07D0567)、凝膠成像分析系統(型號 KETA M):中國臺灣威泰克有限公司。

2 方法

2.1 動物分組 將30只大鼠隨機分為3組:正常組、模型組、灸預處理組,每組10只。實驗過程嚴格遵守中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

2.2 干預與模型復制

2.2.1 艾灸干預治療 正常組和模型組大鼠常規飼養,正常抓取,固定于鼠板,不予干預,每次20 min,每日1次,連續7 d。灸預處理組于實驗第1天起予以艾灸,每日均在上午10時開始進行艾灸治療。取“足三里”(雙)、“中脘”穴。操作:剃除大鼠穴位區域被毛,將大鼠仰臥位固定于鼠板,盡量保持自然狀態,彩色筆標記穴位,采用特制香煙型純艾條固定于懸灸支架上,使艾條點燃部位垂直距離大鼠穴位約2 cm,應用皮膚溫度測定儀將灸處局部溫度控制在42 ℃左右,治療過程中注意處理艾灰,并不斷調整艾條的固定長度,以保持穴區灸溫,每次持續20 min,每日1次,連續7 d。第8天不予干預,自上午10時開始禁食不禁水。

2.2.2 模型復制 參照文獻[10],結合前期經驗[6],制備胃黏膜損傷模型。第9天開始(禁食不禁水24 h)進行模型復制:每日采用無水乙醇灌胃,劑量為每只大鼠6 mL/kg,然后灌胃阿司匹林混懸液200 mg/kg。每日22:00(即每次灌胃前12 h),模型組和灸預處理組禁食不禁水,連續灌胃4 d(第9天至第12天)。

2.2.3 組織取材 模型復制結束后,各組大鼠禁食24 h、禁水8 h,10%水合氯醛腹腔麻醉3 mL/kg,腹主動脈取血,后將胃取出,迅速用生理鹽水沖洗,首先肉眼觀察胃黏膜損傷情況,拍照并進行胃黏膜潰瘍指數(ulcer index, UI)評估。將胃縱切為2份,每一份均含胃底、胃體和胃竇。其中一份胃組織用于蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色和免疫組織化學檢測;另一份胃組織刮取黏膜(置冰上進行),凍存管收集后立即置于液氮-80 ℃保存。

2.3 觀察指標與方法

2.3.1 胃黏膜UI觀察 將大鼠胃黏膜組織平展放置于預冷的濾紙上,參照文獻[11]標準,采用卡尺對損傷部位進行測定。0分為正常,1分為斑點糜爛,2分為糜爛長度小于1 mm,3分為糜爛長度1～2 mm,4分為糜爛長度2～3 mm,5分為糜爛長度大于3 mm。當寬度大于1 mm 時各分值乘以2。UI值為各分值累計相加。

2.3.2 胃黏膜病理學觀察 進行UI觀察后,將含有胃底、胃體和胃竇部分的大鼠胃組織固定后常規石蠟包埋并切片,顯微鏡下觀察胃黏膜病理變化。

2.3.3 大鼠血清TNF-α、IL-6水平 取腹主動脈血自然凝固10～15 min,3 000 r/min離心20 min后收集上清液。嚴格按照ELISA試劑盒的說明書進行操作,檢測大鼠血清TNF-α、IL-6水平。

2.3.4 免疫組織化學法檢測胃黏膜組織TLR4、MyD88、NF-κB p65表達水平 嚴格按照試劑盒方法進行操作,將常規石蠟包埋和組織切片經抗原修復后,用正常羊血清液封閉20 min,將配置好的TLR4工作液(1∶50稀釋),以及MyD88、NF-κB p65一抗工作液(1∶100稀釋)滴在組織上,4 ℃過夜,PBS洗滌后滴加生物素化二抗、辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液,DAB顯色、復染、封片后,拍照并進行圖像分析。

2.3.5 Western blot法檢測胃黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達水平 分別稱取大鼠胃黏膜組織100 mg,剪碎組織后置于裂解液中,勻漿后12 000 r/min離心20 min,提取總蛋白。分別經制膠、上樣、電泳、轉膜和封閉操作后,加入稀釋的TLR4、MyD88和NF-κB (1∶1 000) 一抗,4 ℃孵育、洗膜,二抗(1∶8 000)37 ℃孵育、洗膜,使用凝膠成像儀成像。采用Gel-Pro Analyzer 4軟件對結果進行灰度分析。

2.4 統計學方法 采用SPSS 22.0進行統計分析。采用GraPhad Prism 7.0軟件進行圖表繪制。計量資料比較用單因素方差分析,先進行方差齊性檢驗,方差齊用LSD法分析,方差不齊用Dunnett’sT3法。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 灸預處理對乙醇誘導的胃黏膜損傷大鼠胃黏膜UI的影響 正常組大鼠胃黏膜光滑完整;模型組大鼠胃黏膜可見斑點狀出血灶,UI顯著高于正常組(P<0.05);灸預處理組大鼠胃黏膜僅見少量斑點狀出血,UI顯著低于模型組(P<0.05)。見圖1。

注:A.正常組;B.模型組;C.灸預處理組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.2 灸預處理對乙醇誘導的胃黏膜損傷大鼠胃黏膜組織形態的影響 正常組大鼠胃黏膜各層結構完整、清晰,未見破損,細胞排列緊密、整齊有序,未見脫落及萎縮、水腫及炎癥細胞浸潤等病理現象。模型組大鼠胃黏膜上皮結構破壞嚴重,可見腺體中斷,部分可見紅細胞滲出,腺體擴張,有紅細胞外滲形成出血灶,炎癥細胞浸潤。灸預處理組大鼠胃黏膜損傷情況較輕,結構較清晰,有輕微的上皮細胞脫落,有少量炎性滲出物,可見新生的肉芽組織和毛細血管。見圖2。

注:A.正常組;B.模型組;C.灸預處理組

3.3 灸預處理對乙醇誘導的胃黏膜損傷大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響 與正常組比較,模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,灸預處理組大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見圖3。

注:A.正常組;B.模型組;C.灸預處理組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.4 免疫組織化學法檢測灸預處理對乙醇誘導的胃黏膜損傷大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平的影響 與正常組比較,模型組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65表達水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,灸預處理組TLR4、MyD88、NF-κB p65表達水平均顯著降低(P<0.05)。見圖4。

3.5 Western blot 法檢測灸預處理對乙醇誘導的胃黏膜損傷大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平的影響 與正常組比較,模型組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,灸預處理組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注:A.正常組;B.模型組;C.灸預處理組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

正常情況下,人體胃黏膜能夠抵御物理因素、化學因素以及細菌或毒素等致病因素,當致病因素超出胃黏膜保護的程度,或當胃黏膜自我防御能力不足時,就會引起胃黏膜損傷[12]。胃黏膜損傷的病理狀態,在常見的消化道疾病中均可出現,進行未病先防減輕胃黏膜損傷程度,進而緩解消化系統疾病的發展,在臨床中有重要意義。

中醫認為,脾胃為“后天之本”“氣血生化之源”,脾氣健則氣血足,抵御各種病邪,即陰平陽秘則安和[13]。灸法操作簡便,在“治未病”方面具有優勢。艾灸“養胃”主要體現為調補溫通的作用,艾灸通過溫熱刺激腧穴,調動經絡之氣,從而激發機體自身的調節防御能力,在疾病尚未發生時就進行艾灸,可激發一身經氣,扶助正氣,以防止疾病的發生[14]。本課題組前期研究[5-6]證實,針灸預處理對胃黏膜具有一定的保護作用。

“足三里”作為足陽明經的合穴兼胃腑的下合穴,是主治胃病的首選穴[15],也是歷代醫家防病保健、扶助正氣的必用穴位。中脘作為胃的募穴,善治胃腑病,是防治消化系統疾病的重要腧穴。中脘與足三里“合募配穴”,調理脾胃,補中益氣,相輔相成。

無水乙醇是高刺激性化學類攻擊因子,當其被攝入過量、超出胃黏膜屏障保護的范圍時,則可能產生影響胃黏膜屏障微循環、激發炎癥因子、誘導細胞凋亡等病理變化[16]。乙醇損傷大鼠胃黏膜與人類胃黏膜損傷基本相似,故將其作為研究胃黏膜損傷的經典動物模型[17]。

TNF-α、IL-6是常見的炎癥因子,通常用于評價胃黏膜的損傷程度[18]。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路能夠啟動一系列相關的炎癥信號的級聯反應,引起多種炎癥因子的釋放,如TNF-α和IL-6,在介導炎癥反應中發揮著重要作用[19]。

本研究顯示,與正常組比較,模型組和灸預處理組大鼠血清TNF-α、IL-6水平均顯著升高,與模型組比較,灸預處理組大鼠血清TNF-α、IL-6水平均顯著降低。模型組TLR4、MyD88、NF-κB p65表達水平顯著升高,而灸預處理組TLR4、MyD88、NF-κB p65表達水平均低于模型組,提示艾灸通過調控TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平,增強胃黏膜自我防御能力,通過調控炎癥因子的釋放對抗炎癥反應,以減輕大鼠胃黏膜的損傷。

綜上所述,灸預處理可減輕胃黏膜損傷程度,防止消化系統疾病的發生發展,灸法可通過多個方面激發胃黏膜的保護作用,其作用機制需進一步研究。