肝豆湯調控NLRP3炎癥小體抑制病模型神經炎癥的機制研究

楊瑞楠,程 楠,董健健,徐陳陳,徐樂文,文佩華,張 培

(1.安徽中醫藥大學研究生院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫藥大學神經病學研究所,安徽 合肥 230061)

Wilson病(Wilson’s disease,WD)是由ATP7B基因突變導致銅代謝障礙,進而出現肝臟及神經和精神等多系統癥狀的遺傳病[1]。安徽中醫藥大學神經病學研究所自1970年代開始從中醫證候學及辨證論治方面對WD進行研究,認為WD是由銅毒內聚、肝膽濕熱內蘊所致,創用肝豆湯,通過其清熱解毒、通腑利濕作用治療WD患者,取得顯著的臨床療效[2]。臨床研究發現,肝豆湯可降低WD患者外周血炎癥因子的表達水平,調節WD患者免疫功能。實驗研究[3-4]發現,肝豆湯可減少WD神經細胞的氧化應激損傷,抑制神經細胞凋亡,改善高銅誘導的神經細胞變性壞死。但肝豆湯治療銅蓄積誘導的神經細胞炎癥損傷機制尚未闡明。

研究[5]證明,炎癥反應存在于WD神經細胞內。課題組前期研究[6]發現,Nod樣受體家族含pyrin結構域蛋白3(Nod-like receptor family,pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)炎癥小體在WD神經細胞損傷的病理過程中起重要作用,抑制NLRP3炎癥小體激活可顯著減少WD模型TX小鼠神經炎癥導致的神經細胞損傷,并明顯改善其行為學異常。可見,銅蓄積誘發的炎癥損傷在WD患者腦損傷過程中起重要作用。本實驗以WD動物模型和細胞模型為研究對象,觀察肝豆湯調控NLRP3炎癥小體對高銅誘導神經細胞炎癥損傷的干預作用,為腦型WD的診治提供理論基礎。

1 材料

1.1 細胞與動物 小膠質細胞(BV-2細胞)、海馬細胞(HT-22細胞)購自中國科學院上海細胞庫。從美國Jackson動物實驗中心引進TX種鼠,在中國科學院合肥物質研究院SPF級實驗動物中心進行飼養及傳代繁殖。以50只DL小鼠為對照組,將100只TX小鼠隨機分為模型組和肝豆湯組,每只小鼠均為3月齡,體質量(20±5)g。為保證種鼠及其子代具備WD模型的特性,模型組入組動物均已進行基因檢測。TX小鼠使用許可證號:SYXK(皖)2018-005。SPF級雄性SD大鼠30只,3月齡,體質量(210±25)g,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[生產許可證號:SCXK(魯)2019-0003],飼養于安徽中醫藥大學神經病學研究所實驗動物中心。本實驗經安徽中醫藥大學動物倫理委員會批準(編號:AHUCM-rats-2020022)和中國科學院合肥物質研究院動物倫理委員會批準(編號:IACUC19001)。

1.2 藥物及試劑 肝豆湯(金錢草、澤瀉各24 g,大黃、姜黃、黃連各20 g,三七3 g)飲片購自同仁堂藥店,煎煮2次,將2次藥汁合并,文火煎煮濃縮至150 mL(含生藥0.74 g/mL),冷卻后保存于4 ℃冰箱。按照課題組前期構建的高效液相色譜指紋圖譜分析方法[19],控制肝豆湯的質量。DMEM培養基(CA0002-500ML):中國Sparkjade公司;MEM細胞培養基(10100147)、胎牛血清(11090081):美國Gibco公司;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-1)(ab138483)、NLRP3(ab270449)、含CARD結構域的凋亡相關顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)(ab175449)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)(ab254360):英國Abcam。

1.3 儀器 CK2型倒置相差顯微鏡:日本Olympus公司;Fine Do X6型全自動化學發光圖像分析系統:上海天能科技有限公司;Power Pac Basic 型電泳儀:美國伯樂公司。

2 方法

2.1 細胞培養及傳代 將HT-22及BV-2細胞置于37 ℃、5% CO2的條件下培養,細胞生長至密度約為80%時進行傳代。

2.2 含藥血清制備及保存 將30只SD大鼠適應性喂養1周后,每日分2次予以肝豆湯8 mL/kg(相當于60 kg成人臨床劑量的6.3倍)灌胃,灌胃4周后,用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg深度麻醉,腹主動脈無菌采血,將血液靜置于室溫2 h后,3 000 r/min離心15 min,取上清。再6 700 r/min、4 ℃離心30 min,取上清,過濾,放置56 ℃水浴中滅活30 min,-20 ℃保存。

2.3 倒置相差顯微鏡下觀察BV-2細胞活化水平 取對數生長期的BV-2細胞,消化收集,細胞懸液接種于96孔板,每組設6個復孔。當細胞生長至90%時,各組加入MEM或CuCl2培養液100 μL,作用時間結束后,于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態,并對活化細胞計數。

2.4 CCK-8法檢測細胞存活率 取對數生長期的細胞,消化收集,細胞懸液接種于96孔板,每組設6個復孔。當細胞生長至90%時,各組加入所需培養液100 μL,作用時間結束后,避光下每孔加入CCK8溶液10 μL,置于37 ℃、5% CO2條件下培養1.5 h后測試吸光度。

2.5 細胞條件培養 傳代BV-2細胞,設正常組、模型組、5%肝豆湯血清組、10%肝豆湯血清組、15%肝豆湯血清組,當細胞生長至90%時,棄去原培養液,條件培養正常組加入MEM完全培養液;條件培養模型組加入含10 μmol/L CuCl2的MEM;各肝豆湯血清組先加入不同濃度含肝豆湯血清培養液作用1 h,后加入含10 μmol/L CuCl2的MEM;12 h后,各組棄去原培養液,加入DMEM完全培養液,作用24 h后,收集上清,將其分別加入HT-22細胞正常組、模型組、5%肝豆湯血清組、10%肝豆湯血清組、15%肝豆湯血清組中,24 h后收集上清及細胞。

2.6 細胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率及氧化應激水平檢測 收集條件培養的各實驗組培養液100 μL,依據LDH檢測試劑盒說明書操作,檢測各組細胞LDH漏出率;收集條件培養的各實驗組細胞,按照索萊寶公司活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒說明書裝載熒光探針DCFH-DA,檢測各組細胞DCF熒光強度;收集條件培養的各實驗組細胞,依據索萊寶公司丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG)活性檢測試劑盒說明書操作,在酶標儀各指標所需波長處檢測吸光度值,根據細胞檢測公式計算MDA、SOD、H2O2、GSH、GSSG水平。

2.7 BV-2細胞的分組及處理 體外傳代并培養BV-2細胞,分為正常組、模型組、5%肝豆湯血清組、10%肝豆湯血清組、15%肝豆湯血清組,各肝豆湯血清組先加入不同濃度含肝豆湯血清的培養液作用1 h,后同模型組一起加入含 10 μmol/L CuC12的MEM作用12 h,干預結束后收集各組上清及細胞。

2.8 酶聯免疫吸附試驗檢測各組細胞炎癥因子水平 收集各組BV-2細胞上清,按試劑盒說照書檢測各組細胞IL-1β、白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、誘導型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase,iNOS)水平。

2.9 動物分組及給藥方法 分為正常組(DL小鼠50只)、模型組(TX小鼠50只)、肝豆湯組(TX小鼠50只)。對各組小鼠灌胃28 d,正常組與模型組采用生理鹽水(20 mL/kg)灌胃,肝豆湯組采用肝豆湯(20 mL/kg)灌胃,每日2次,末次給藥后,用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后處死小鼠,于冰上取小鼠海馬組織進行腦組織損傷水平及NLRP3炎癥小體相關蛋白表達水平檢測。

2.10 行為學檢測

2.10.1 Barnes迷宮 設置迷宮所需圓形平臺,直徑為122 cm,高99 cm,平臺周邊有20個均勻分布的直徑為10 cm的孔,各孔外觀均勻,平臺中央設置1個黑色可移動的逃生盒,只有1個孔連接到逃生盒,實驗前先將小鼠放在逃生盒熟悉環境,30 s后將小鼠拿到平臺,計時3 min,觀察小鼠能否找到逃生盒及其找到目標洞口的潛伏期。

2.10.2 曠場實驗 試驗所需的裝置為方形箱子,規格為50 cm×50 cm×40 cm,其底部分為邊緣區(1區)、中間區(2區)、中心區(3區)。實驗所需全部小鼠被放入實驗區域同一位置,觀察其自由活動,時間為5 min。

2.10.3 高架十字實驗 設置實驗所需兩條相對開放臂和兩條相對閉合臂及中央區,實驗前將小鼠放置于裝置內適應30 min,正式測試時,從中央區放進動物(面對閉合臂),觀察其進入2種臂的次數及所停留的時間。進行以上實驗時,每測試完一只小鼠,清除其糞便、尿液,并用75%乙醇無菌操作。以上實驗的檢測與分析使用Ethovision XT系統進行。

2.11 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法檢測腦組織形態 將腦組織進行固定等前期處理后切片,厚度為4 μm,山羊血清封閉,蘇木精和伊紅染液染色,于顯微鏡下觀察腦損傷情況。

2.12 Western blot檢測NLRP3炎癥小體相關蛋白表達水平 取各組海馬組織,加入PMSF和RIPA裂解液及磁珠研磨;取各組BV-2細胞,加入PMSF和RIPA裂解液,冰上裂解30 min。隨后4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min,取上清液,加入蛋白上樣緩沖液后,立即水浴8 min,隨后保存于-20 ℃冰箱。電泳后將蛋白進行轉膜。常溫封閉4 h,一抗4 ℃過夜孵育,二抗室溫搖床孵育1.5 h后曝光,后用Image J軟件(1.53版本,美國國立衛生研究院)分析條帶灰度值。

3 結果

3.1 CuCl2誘導BV-2細胞活化 與正常組比較,加入CuCl2后,BV-2細胞表面突起逐漸收縮,并呈現出胞體增大、突起變短、細胞形態呈圓形的活化狀態。2～200 μmol/L CuCl2激活的BV-2細胞活化率顯著增加(P<0.05)。見圖1。

注:A.正常組;B.模型組;與正常組(0 μmol/L CuCl2組)比較,*P<0.05

3.2 CuCl2誘導BV-2細胞活化間接引起HT-22細胞損傷 對BV-2細胞和HT-22細胞單獨予以不同濃度CuCl2處理。CCK8檢測結果顯示,與正常組比較,CuCl2在1～50 μmol/L濃度范圍內未引起顯著的BV-2細胞及HT-22細胞死亡(P>0.05)。見圖2。BV-2細胞與HT-22細胞條件培養下,10 μmol/L CuCl2可顯著降低HT-22細胞存活率(P<0.05)。見圖3。

注:與正常組比較,*P<0.05

注:A.正常組;B.模型組;與正常組比較,*P<0.05

3.3 含肝豆湯血清減輕CuCl2誘導條件培養對HT-22細胞的損傷 將不同濃度含肝豆湯血清單獨作用于HT-22細胞及BV-2細胞,分為正常組、5%肝豆湯血清組、10%肝豆湯血清組、15%肝豆湯血清組、20%肝豆湯血清組。CCK8檢測結果顯示,與正常組比較,各組細胞存活率無明顯變化(P>0.05)。見圖4。將不同濃度含肝豆湯血清作用于條件培養細胞,10%和15%含肝豆湯血清可顯著提高模型組條件培養細胞活力(P<0.05)。見圖5。

注:A.正常組;B.5%肝豆湯血清組;C.10%肝豆湯血清組;D.15%肝豆湯血清組;E.20%肝豆湯血清組

注:A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.4 含肝豆湯血清可抑制CuCl2誘導BV-2細胞的活化 與正常組比較,經CuCl2損傷后,細胞折光性顯著下降,表面突起逐漸皺縮,并呈現出胞體增大、突起變短、呈圓形的活化狀態,細胞貼壁不良,細胞密度降低;與模型組比較,肝豆湯組細胞表面突起伸出,貼壁狀態得到改善,折光性較模型組顯著增強。見圖6。

注:A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組

3.5 含肝豆湯血清可降低CuCl2條件培養的HT-22細胞LDH漏出率 模型組條件培養細胞上清液中LDH活力較正常組顯著增加(P<0.05);與模型組比較,肝豆湯組細胞上清液中LDH活力均顯著降低(P<0.05)。見圖7。

注:A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.6 含肝豆湯血清可降低CuCl2條件培養的HT-22細胞氧化應激水平 與正常組比較,模型組ROS活性,MDA、H2O2水平顯著升高(P<0.05),SOD活力、GSH/GSSG顯著降低(P<0.05);與模型組比較,肝豆湯組ROS活性,MDA、H2O2水平顯著降低(P<0.05),SOD活力、GSH/GSSG顯著升高(P<0.05)。見圖8。

注:圖①為ROS峰線圖;A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.7 含肝豆湯血清可抑制CuCl2誘導的BV-2細胞炎癥因子分泌 與正常組比較,模型組BV-2細胞中IL-1β、IL-18、TNF-α、iNOS水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,含肝豆湯血清可劑量依賴性降低CuCl2誘導的BV-2細胞中IL-1β、IL-18、TNF-α、iNOS水平(P<0.05)。見圖9。

注:A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.8 含肝豆湯血清可下調CuCl2誘導的BV-2細胞NLRP3炎癥小體相關蛋白表達水平 與正常組比較,模型組Caspase-1、NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,含肝豆湯血清可降低Caspase-1、NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表達(P<0.05)。見圖10。

注:A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.9 肝豆湯可改善TX小鼠行為學異常 從各組小鼠中隨機選取38只進行行為學試驗。Barnes迷宮中,肝豆湯可顯著縮短TX小鼠進入目標洞潛伏期(P<0.05)。高架十字迷宮中,肝豆湯治療組小鼠開臂進入次數百分比、開臂持續時間顯著升高(P<0.05)。曠場實驗中,肝豆湯可顯著增加TX小鼠運動中央時間、總路程、直立次數(P<0.05),降低TX小鼠邊上時間、靜止時間(P<0.05)。見圖11。

注:A.正常組;B.模型組;C.肝豆湯組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.10 肝豆湯可減輕TX小鼠海馬組織神經細胞損傷 HE染色結果顯示,正常組海馬組織細胞形態正常,周圍神經纖維緊密,未見明顯異常。模型組海馬組織細胞排列稀疏,多見錐體細胞壞死,核固縮或溶解消失(黑色箭頭)。肝豆湯組海馬組織細胞形態規則,排列整齊,神經細胞核大而圓,細胞質豐富,淺藍色或藍色均勻,核仁清楚,層次及細胞線清晰。見圖12。

注:A.正常組;B.模型組;C.肝豆湯組;箭頭示核固縮或溶解消失

3.11 肝豆湯抑制TX小鼠海馬組織NLRP3炎癥小體活化 口服中藥肝豆湯能同時阻斷TX小鼠海馬組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC蛋白的表達(P<0.05)。見圖13。

注:A.正常組;B.模型組;C.肝豆湯組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

人體神經系統功能維持正常需要銅的參與。當神經細胞內銅穩態失調時,高濃度銅離子可誘導以小膠質細胞活化為特征的炎癥反應并引起神經損傷[7-8]。有研究[5]發現,多種神經遺傳變性疾病中樞神經系統損傷的重要機制之一為炎癥反應,其特征為小膠質細胞活化,活化的小膠質細胞能夠促進神經系統損傷的修復,而當炎癥反應長期慢性存在時,則會加重神經系統的損傷。銅離子在腦中堆積引起的膠質細胞活化及神經細胞變性壞死是WD神經細胞損傷的重要機制,并有可能是治療的重要靶點[9]。本實驗發現,模型組小膠質細胞活化,且促使條件培養下的HT-22細胞氧化應激水平增高及細胞損傷,炎癥因子表達水平較正常組顯著增加。結果表明,WD細胞模型中銅離子沉積能誘導BV-2細胞活化,促進炎癥因子分泌,從而加劇神經細胞損傷。此外有研究[10]發現,TX小鼠腦內銅沉積區域存在小膠質細胞活化及炎癥因子分泌,并伴有神經細胞的變性壞死。以上提示炎癥是WD神經細胞損傷的重要機制。

作為一種多蛋白復合物,NLRP3炎癥小體由NLRP3、Caspase-1前體和ASC構成,在腦內主要在小膠質細胞和星形膠質細胞內表達[11]。近年來研究[12-13]證明,NLRP3炎癥小體活化與多種神經系統遺傳、變性疾病相關。NLRP3炎癥小體與WD神經細胞損傷緊密相關。Dong等[6]研究發現,在WD小鼠模型中,NLRP3炎癥小體對炎癥因子的釋放有促進作用,出現腦組織病理性損傷,而沉默NLRP3或藥物抑制NLRP3炎癥小體激活可改善銅堆積導致的神經細胞病理性損傷,從而防止神經退行性變。本實驗發現,與正常組比較,TX小鼠海馬組織NLRP3炎癥小體相關蛋白Caspase-1、NLRP3、IL-1β、ASC表達水平升高。亦有多項研究[14-17]發現,激活的NLRP3炎癥小體釋放炎癥因子,造成細胞損傷。

WD的中醫辨證復雜多變,但是驅“銅毒”仍然是主要的治療目標[18],肝豆湯各藥物配合,共同發揮瀉火解毒、清瀉濕熱、瀉下攻積、活血祛瘀的作用。課題組前期建立了肝豆湯的高效液相色譜指紋圖譜,從而良好控制了肝豆湯的質量,并發現鹽酸小檗堿是其主要成分之一[19]。研究[20]發現,鹽酸小檗堿可能通過阻斷三叉神經痛大鼠的NLRP3炎癥小體通路,降低其神經系統炎癥反應,從而減輕神經節間的痛覺傳遞。本實驗發現,肝豆湯可顯著抑制WD細胞模型BV-2細胞的活化,減少BV-2細胞炎癥因子的分泌,降低氧化應激水平,減輕神經細胞病理性損傷,顯著提高條件培養HT-22細胞的存活率。為了進一步研究肝豆湯對NLRP3炎癥小體的調控作用,給予TX小鼠口服肝豆湯治療,并將含肝豆湯血清作用于細胞,結果發現,肝豆湯可顯著降低TX小鼠海馬組織及體外BV-2細胞NLRP3炎癥小體相關蛋白Caspase-1、NLRP3、IL-1β、ASC的表達水平;肝豆湯可減輕TX小鼠海馬組織神經細胞壞死,改善TX小鼠認知及運動功能損傷。以上結果表明,肝豆湯可抑制NLRP3炎癥小體活化,減輕TX小鼠腦內銅沉積引起的病理損傷,改善TX小鼠行為學異常。

綜上所述,NLRP3炎癥小體激活是WD病理進程中的重要環節,肝豆湯可通過抑制NLRP3炎癥小體激活,顯著減少神經細胞炎癥損傷,改善WD小鼠的認知及行動功能障礙,進而保護神經細胞。因此,抑制NLRP3炎癥小體激活可能是肝豆湯治療WD的機制之一。然而,本實驗仍有局限性,NLRP3炎癥小體的激活和調控方法以及肝豆湯在其中發揮作用的機制仍需研究。因此,今后應進一步對NLRP3炎癥小體上游及下游的信號通路進行深入研究,以便為治療WD提供新的思路。