桃紅四物湯干預后的血小板外泌體對腦缺血再灌注模型大鼠的血管新生作用

武 瑞,戴文濤,張亞南,侯欣宇,彭代銀,3,韓 嵐

(1.安徽中醫藥大學藥學院,安徽 合肥 230012;2.中藥復方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;3.安徽道地中藥材品質提升協同創新中心,安徽 合肥 230012)

外泌體(exosomes,Exos)是細胞通向細胞外分泌的直徑40～100 nm的囊泡樣小體,本質是脂質雙分子層[1]。其可由多種細胞分泌產生,如淋巴細胞、樹突狀細胞、內皮細胞、間充質干細胞和血小板。Exos中包含多種蛋白質、脂類和遺傳物質,是細胞間物質傳遞和信息交流的一種重要方式,在神經再生、血管新生、免疫應答、抗原呈遞以及RNA和蛋白質轉運等方面具有生物學功能。有研究[2]顯示,外泌體還具有穿過血腦屏障的能力。血小板來源的外泌體(platelet-derived exosomes,PLT-Exos)攜帶多種細胞因子、生長因子、凝血因子和幾種類型的RNA,并作為血小板與細胞間相互作用的主要遞質而成為研究熱點[3-4]。研究表明,PLT-Exos可以通過升高黏附蛋白的表達水平和降低抗黏附因子的水平增強內皮細胞的黏附能力[5-7],且對間充質干細胞的增殖、遷移和分化有積極的影響[8]。PLT-Exos能有效誘導內皮細胞和成纖維細胞的增殖和遷移,從而改善大鼠慢性傷口的血管生成和上皮化[9]。因此,PLT-Exos逐漸成為近年來生物醫學領域研究的一大熱點,并且在缺血性腦損傷的診斷和治療方面顯示出極大的潛能。

近年來研究[10]發現,腦組織血管密度增高與腦缺血再灌注損傷預后的改善有關[10]。人們開始研究腦缺血再灌注損傷后的血管新生,新生血管使腦缺血后的缺血周圍組織腦血流量和腦血流體積增加,從而恢復腦卒中后損傷的神經功能。許多傳統中藥復方包含多種生物活性成分,可抑制炎癥細胞因子釋放,抑制血小板和血管內皮細胞中黏附分子的表達,以及抗血栓形成[11-13],具有促進血管新生的作用。桃紅四物湯(Taohong Siwu Decoction,THSWD)源自清代吳謙所著的《醫宗金鑒》,由桃仁、紅花、熟地黃、當歸、白芍、川芎6味藥組成,是治療血瘀證的經典方劑。THSWD的臨床應用非常廣泛,可治療多種血瘀證疾病。本課題組前期研究[14]表明,THSWD對腦缺血再灌注損傷具有良好的血管生成和神經保護作用,其機制涉及促進腦血管生長,包括調控血小板所釋放的另一種膜顆粒——血小板微顆粒(platelet microparticles,PMPs)攜帶的血管生成相關信號分子和Notch信號通路的激活。本研究旨在觀察桃紅四物湯調控的血小板源外泌體(THSWD-PLT-Exos)對腦缺血再灌注模型大鼠血管新生的作用。

1 材料

1.1 儀器與試藥 CD63抗體、TSG101抗體:江蘇Affinity公司;5-溴-2′-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)、血管性假血友病因子(von Willebrand factor,vWF)、CD9抗體:北京Bioss公司;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI):上海Beyotime公司;凝血酶:北京Solarbio公司。

高速冷凍離心機:德國Eppendorf公司;超高速離心機:美國Beckman公司;透射電子顯微鏡:美國ThermoFisher公司;Nano Sight粒徑分析儀:英國Malvern公司;激光多普勒血流儀:瑞典Perimed公司;石蠟包埋機:孝感市亞光醫用電子技術有限公司;倒置顯微鏡:日本Olympus公司。

1.2 動物 SPF級SD大鼠,雄性,體質量170～210 g,購自遼寧長生生物技術股份有限公司[生產許可證號 SCXK(遼)2020-0001],經安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準,動物倫理編號: AHUCM-rats-202287,常規飼養。

2 方法

2.1 桃紅四物湯的制備 按質量比4∶3∶3∶2∶3∶2稱取熟地黃、當歸、白芍、川芎、桃仁、紅花6味藥材,加入藥物總質量10倍量的75%乙醇冷凝回流提取2 h,過濾并保留濾液,濾渣加入藥物原總質量8倍量的75%乙醇冷凝回流提取2 h后再過濾,將兩次濾液合并,旋轉蒸發濃縮成1.8 g/mL的濃縮液,-20 ℃保存備用。

2.2 PLT-Exos的制備 取大鼠30只,分成THSWD組和正常對照組,每組15只,THSWD組按18 g/kg灌胃給予THSWD,每日1次,連續7 d;正常對照組大鼠以等量生理鹽水灌胃,每日1次,連續7 d。以超高速差速離心法[15]提取EXOS:首先采用腹主動脈取血法分別收集各組大鼠全血樣品,以9∶1的比例加入2.5%枸櫞酸鈉抗凝溶液中;200g離心12 min,上清為富血小板血漿。吸取上清至新離心管;900 g離心12 min,沉淀即為血小板;吸棄上清,2 mL Tyrodes緩沖液37 ℃重懸血小板。使用凝血酶(1 U/mL)體外處理血小板,37 ℃水浴孵育1 h,促進血小板激活和凝集。反應之后,以2 500g離心15 min,上清為血小板分泌的細胞外顆粒。將上清移至超速離心管,加PBS至7～8 mL,其余離心管用水配平。4 ℃、20 000g離心40 min,沉淀為血小板釋放的微囊泡,上清為富Exos溶液。將上清移至新超速離心管,配平后在120 000g、4 ℃條件下離心70 min,沉淀為Exos。棄去上清后,用100 μL PBS重懸Exos。

2.3 大鼠腦缺血再灌注模型的制備 參照線栓法[16]制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。假手術組不作插線處理,其余手術步驟同模型組。24 h后進行神經功能學評分,驗證動物模型是否復制成功。

2.4 分組與給藥 將復制成功的腦缺血再灌注模型大鼠分為假手術組、模型組、THSWD-PLT-Exos組、PLT-Exos組、對照組,每組3只。THSWD-PLT-Exos組通過尾靜脈注射0.5 mg/kg的THSWD-PLT-Exos;PLT-Exos組通過尾靜脈注射0.5 mg/kg的PLT-Exos;此兩組共注射3次,以星期一、星期三、星期五為時間點。模型組與假手術組在同時間點注射等量生理鹽水,對照組通過尾靜脈注射25 mg/kg的丁苯酞注射液[17]。

2.5 觀察指標及方法

2.5.1 透射電子顯微鏡觀察PLT-Exos形態 取15 μL的樣本于銅網上靜置1 min。使用濾紙將銅網上的Exos樣本吸干后,滴加15 μL的2%醋酸雙氧鈾染色液室溫染色1 min。使用濾紙吸干液體,將染色完成的樣本置于白熾燈下照射10 min,常溫干燥,透射電子顯微鏡下觀察拍照,保存圖片。

2.5.2 Western blot法檢測PLT-Exos標志蛋白的表達水平 用50 μL蛋白裂解液重懸Exos,冰上渦旋裂解30 min;12 000 r/min、4 ℃離心15 min,將上清液吸取至干凈的EP管。按照BCA試劑盒說明書測定蛋白質濃度。配制SDS-PAGE,電泳,轉膜,孵育一抗CD9(1∶1 000)、CD63(1∶1 000)、TSG101(1∶1 000)過夜,孵育二抗,顯影,成像。以提取的血小板作為對照。

2.5.3 納米粒徑分析儀檢測PLT-Exos粒徑 使用NanoSight N300檢測所提取PLT-Exos的粒徑。實驗前先以去離子水清洗樣本池。再次以PBS清洗樣本池,上機檢測前使用PBS稀釋Exos至合適的濃度,將稀釋好的Exos樣本注射到樣品室中,每個樣本檢測重復3次。

2.5.4 激光多普勒血流儀檢測大鼠腦血流量 采用激光多普勒檢測大鼠腦血流量的改變。大鼠麻醉后,采用手術刀于大鼠腦部同側囟門后中線外5 mm位置切開,清理顱骨表面筋膜,將探頭固定到顱骨上,連續檢測至基線穩定,截取5 min穩定的基線作為參考數據,單位為灌注單位(perfusion unit,PU)。

2.5.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin ,HE)染色法觀察大鼠腦海馬組織的病理變化 將大鼠麻醉后仰臥位固定于操作臺上,打開胸腔,使用0.9%生理鹽水灌注心臟10 min 后,4%多聚甲醛水溶液灌注心臟15～20 min,取出腦組織,浸泡于4%多聚甲醛水溶液,于4 ℃保存,石蠟包埋切片。

2.5.6 免疫熒光染色法觀察大鼠腦BrdU和vWF的表達水平 模型復制后第5天,分別于8:00、10:00、12:00和14:00對大鼠腹膜內注射50 mg/kg Brdll。于模型復制后第7天,將大鼠大腦取出。切片用一級抗體(BrdU,1∶100;vWF,1∶300)孵育,然后用熒光染料標記的二級抗體孵育。最后,在室溫下用DAPI染色細胞核5 min,封片拍照。

3 結果

3.1 透射電子顯微鏡下PLT-Exos的形態 透射電子顯微鏡下PLT-Exos的形態特征為茶托狀或杯狀結構,直徑在100 nm以內,符合Exos形態要求。見圖1。

3.2 Western blot法檢測Exos標志蛋白 Western blot法檢測Exos標志蛋白CD63、CD9和TSG101,發現CD63、CD9和TSG101在所提取的樣本中呈陽性表達,符合Exos表征蛋白的表達,表明本實驗所提取的樣本為PLT-Exos。見圖1。

注:A.PLT-Exos;B.血小板

3.3 納米粒徑分析儀檢測PLT-Exos的粒徑 納米粒徑分析檢測結果顯示,外泌體樣本的實測平均粒徑為90.5 nm,提示本實驗超速離心所提取的PLT-Exos的樣本粒徑符合30～100 nm的分布范圍。見圖2。

圖2 納米粒徑分析儀實時觀察PLT-Exos(A,箭頭標記為

3.4 大鼠缺血側腦血流量比較 與假手術組比較,模型組大鼠的腦血流量明顯減少;與模型組比較,THSWD-PLT-Exos組、PLT-Exos組及對照組大鼠的腦血流量明顯增加。見圖3。

注:A.假手術組;B.模型組;C.THSWD-PLT-Exos組;D.PLT-Exos組;E.對照組;與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.5 各組大鼠腦海馬組織病理變化 假手術組大鼠海馬區的腦組織結構完整,神經細胞形態正常、邊界清晰、排列規則,細胞核完整,核膜連續,細胞質飽滿;模型組大鼠海馬區腦組織結構比較疏松,神經細胞損傷比較嚴重、邊界不清、排列不規則,細胞核固縮,核膜不完整,細胞周圍間隙增大,胞質中可見空泡;THSWD-PLT-Exos組、PLT-Exos組大鼠海馬組織均呈輕度缺血性改變,損傷程度較模型組輕,細胞狀態較好,核大而圓,核仁較清晰,各項病理改變均有明顯改善;對照組大鼠海馬組織損傷情況較輕,細胞核皺縮和間質水腫的情況較模型組有較大減輕。見圖4。

注:A.假手術組;B.模型組;C.THSWD-PLT-Exos組;D.PLT-Exos組;E.對照組

3.6 各組大鼠腦組織BrdU和vWF免疫熒光表達水平比較 免疫熒光染色結果顯示,與假手術組比較,模型組腦組織中BrdU和vWF的表達水平明顯增高(P<0.05);與模型組比較,THSWD-PLT-Exos組和PLT-Exos組腦組織中BrdU和vWF的表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖5。

注:免疫熒光圖(左圖);BrdU/vWF熒光信號的定量(右圖);A.假手術組;B.模型組;C.THSWD-PLT-Exos組;D.PLT-Exos組;E.對照組;與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

大量研究表明,腦缺血所導致的腦損傷是一個復雜的病理過程,發病早期以大量氧自由基的產生、腦水腫及興奮性氨基酸毒性為主;中期以炎癥、神經元凋亡為主;后期以神經再生、血管新生和膠質細胞增殖等腦重構表現為主。而腦血管新生為神經元重構提供了關鍵的神經血管底物,能及時恢復局部腦供血,對損傷后功能恢復非常關鍵[18]。缺血性腦卒中血管的新生在很大程度上依賴于血流量的恢復。新形成的血管將增加腦血流量,從而增加氧和營養物,使腦內的能量狀態趨于穩定,腦組織得以生存。因此,血管新生對腦損傷后的恢復起著重要作用。

對Exos進行研究,首先應提取高純度Exos并對其進行鑒定。常見的Exos分離方法主要有5種,包括超速差速離心法、超濾法、沉淀法、免疫親和法和微流體分離法。目前,大多數研究者選用超速差速離心法分離Exos。此方法通過逐步遞增的離心力和離心時間,以去除細胞、細胞碎片和較大的細胞外囊泡,從而獲得純度較高的Exos。國際細胞外囊泡學會在指南中給出了鑒定Exos的方法,即采用NTA、透射電子顯微鏡和標志蛋白的檢測進行鑒定[19]。本研究首先分離出經THSWD灌胃1周的大鼠全血中的血小板,再通過逐步離心提取PLT-Exos,經過上述NTA和透射電子顯微鏡觀察,選取CD9、CD63、TSG101標志蛋白對Exos進行鑒定,確定PLT-Exos已被成功提取分離。

相關研究[20]表明,THSWD具有干預血小板活化的抗凝祛瘀作用,包括抑制大鼠血小板聚集,降低血瘀大鼠血漿中血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)、vWF等因子水平,調節血小板釋放血管內皮生長因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)及內皮抑素。PLT-Exos是從活化的血小板上脫落的脂膜,具有與血小板類似的生物功能[21],可將其生物內容物傳遞到受體細胞,參與血小板和內皮細胞的活化及凝血的調節[22]。有研究表明,PLT-Exos具有抗凝的作用,可以在體外抑制血小板聚集,并減少血小板與體內受損血管中膠原的黏附。PLT-Exos降低了血小板的反應性,抑制血管血栓的形成。如在動脈粥樣硬化中,活化的PLT-Exos可顯著降低血小板Ⅱ型清道夫受體CD36的表達水平,從而減少血小板聚集,抑制血栓形成[23]。

Exos具有的生物特點優勢,可以使其可穿過血腦屏障。研究[24]表明,Exos可作為載體將藥物傳遞至靶器官,一些中藥可以干預某些細胞或其所釋放的Exos,影響其中攜帶的內容物如蛋白、miRNA,從而達到治療效果。如通過補陽還五湯調控后的間充質干細胞分泌的Exos可增加腦缺血大鼠腦血管的生成,其作用可能是補陽還五湯上調了間充質干細胞Exos中血管生成相關miRNA和血管內皮生長因子的表達水平。經黃芩苷干預的大鼠腦微血管內皮細胞Exos,對血腦屏障中緊密連接蛋白具有上調作用[25]。課題組前期研究已驗證了THSWD可調節多種血小板微顆粒中攜帶的血管生成相關蛋白,包括生長因子、基質金屬蛋白酶、趨化因子等[14]。因此,本研究觀察THSWD-PLT-Exos對缺血大鼠腦的作用,發現THSWD-PLT-Exos對大鼠腦血管新生的作用優于PLT-Exos,推斷THSWD-PLT-Exos存在,并且THSWD對PLT-Exos具有一定的調控作用,但其機制需進一步研究。

血管生成在腦缺血損傷后被激活,目前普遍認為血管新生改善了缺血區的血液供應[26]。臨床常依據腦血流灌注量判斷缺血性腦卒中患者的病情[27]。本研究結果顯示,經THSWD-PLT-Exos處理的大鼠腦血流量明顯上升。病理切片結果顯示,THSWD-PLT-Exos組大鼠海馬區細胞形態較完整、排列整齊,核仁和胞漿界限清晰,病變程度有明顯改善。免疫熒光染色中,BrdU用于標記最近增殖的細胞,vWF由內皮細胞和巨核細胞釋放,是一種大型多聚體糖蛋白,通過涉及VEGFR-2 信號傳導和血管生成素-2的多種交叉通路調節血管生成[28],因此,vWF被認為是內皮細胞損傷的標志。本研究發現,兩組Exos組中,腦組織中BrdU和vWF的表達水平較高。這表明THSWD-PLT-Exos可以促進新生細胞的增殖,并增加損傷后的血管內皮細胞,說明其具有神經和血管生成的作用。

前期研究結果表明,THSWD對腦缺血再灌注損傷具有良好的血管生成和神經保護作用,包括促進PMPs所攜帶血管生成相關信號分子的調節和Notch信號通路的激活。本研究發現,THSWD作為治療缺血性腦卒中的藥物,經其干預后提取的PLT-Exos也具有一定的血管生成和神經保護作用,其原因可能是調控了PLT-Exos中所攜帶的血管生成相關蛋白。今后將對其所攜帶的相關蛋白的表達進一步研究,以探討其作用機制。