基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究小柴胡湯治療三陰性乳腺癌的作用機(jī)制

丁 然,劉啟偉,余 靜,闞紅星,楊銀鳳

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)藥信息工程學(xué)院,安徽 合肥 230012)

乳腺癌屬于中醫(yī)學(xué)“乳石癰”“乳巖”等范疇,中醫(yī)認(rèn)為其發(fā)病與情緒有一定的關(guān)系。《婦人大全良方》曰:“此病屬肝脾郁怒,氣血虧損。”《外科正宗》曰:“又憂郁傷肝,思慮傷脾,積想在心,所愿不得志者,致經(jīng)絡(luò)痞澀,聚結(jié)成核。”可見(jiàn),疏肝解郁法在乳腺癌的治療中較為關(guān)鍵。中醫(yī)認(rèn)為肝在女子的生理病理過(guò)程中具有重要作用,氣滯血瘀、肝失條達(dá),會(huì)導(dǎo)致疾病進(jìn)一步惡化,病情不斷加重甚至死亡。研究[1]顯示,乳腺癌患者常見(jiàn)的中醫(yī)證型為肝郁氣滯和肝郁脾虛,因此治療可從肝膽著手,其基本治法為疏肝理氣。小柴胡湯出自張仲景的《傷寒論》,由柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、生姜、大棗7味中藥組成,是和解少陽(yáng)的典型方劑。黃芩苦寒,清泄邪熱;柴胡苦平,疏泄郁滯之氣;黃芩、半夏降泄,柴胡升散,共同使用可以清熱透邪、疏通經(jīng)氣。大棗、人參有扶正御邪、益氣健脾的功效;甘草、白術(shù)有健脾益氣的作用[2];諸藥合用可以緩解病情,解除肝膽少陽(yáng)郁滯之氣。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌的一個(gè)亞型,為缺乏雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因表達(dá)的乳腺癌[3-4]。TNBC因具有較高的內(nèi)臟轉(zhuǎn)移率且缺乏公認(rèn)的治療靶點(diǎn),被認(rèn)為是一種高度異質(zhì)性的疾病。Ⅱ期或Ⅲ期TNBC患者有較高的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)。

臨床研究[5]表明,小柴胡湯對(duì)乳腺癌具有顯著的治療作用。從多成分—多靶點(diǎn)—多通路的角度闡述藥物的作用機(jī)制,具有較強(qiáng)的整體性,與中醫(yī)學(xué)的整體觀念相一致[6]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究小柴胡湯治療TNBC的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 小柴胡湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建 基于化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.organchem.csdb.cn)和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)以及文獻(xiàn)挖掘獲得小柴胡湯中的中藥活性成分并建立相應(yīng)化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 藥效動(dòng)力學(xué)篩選 選擇藥效動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行預(yù)測(cè),把滿足口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(druglike,DL)≥0.18的有效成分作為候選化合物。兩種方式篩選出的化學(xué)成分作為小柴胡湯的有效化學(xué)成分。

1.3 靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用支持向量機(jī)(support vector machine,SVM)和隨機(jī)森林(random forest,RF)算法以及DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca)預(yù)測(cè)基因靶點(diǎn),并設(shè)置參數(shù)滿足SVM≥0.7、RF≥0.8的基因靶點(diǎn)作為候選靶點(diǎn)。

1.4 中藥靶點(diǎn)篩選 通過(guò)整理中藥的有效活性成分,在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)的基礎(chǔ)上繼續(xù)搜集有效活性成分的靶蛋白,通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)的背景知識(shí),對(duì)調(diào)控靶蛋白表達(dá)的基因進(jìn)行注釋。

1.5 成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的建立 為了進(jìn)一步解釋小柴胡湯與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的作用網(wǎng)絡(luò),將前期整理好的活性成分?jǐn)?shù)據(jù)與對(duì)應(yīng)靶蛋白進(jìn)行映射,導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1構(gòu)建小柴胡湯與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,節(jié)點(diǎn)和邊表達(dá)了每個(gè)因子與它們的相互關(guān)系。

1.6 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 從Metabric數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov)下載乳腺癌的基因表達(dá)矩陣。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析是一種系統(tǒng)生物學(xué)方法,可用于識(shí)別候選生物標(biāo)志物或相關(guān)的基因聚類模塊[7],通過(guò)這種方法可以得到重要模塊中所有基因的基因顯著性,其反映基因與不同乳腺癌亞型之間的相關(guān)性。最后選取特定模塊中的基因進(jìn)行后續(xù)分析。

1.7 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果和藥物靶點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合分析,兩個(gè)部分中的重疊基因可能是小柴胡湯活性成分治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。將重疊基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org),物種選擇“Homo sapiens”,評(píng)分值大于0.7。結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),根據(jù)度值選擇核心基因。

1.8 基因的功能與通路基因注釋 利用R語(yǔ)言的clusterProfiler 3.16(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html)進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析,研究與TNBC發(fā)生發(fā)展和中藥治療相關(guān)的潛在生物功能和通路。設(shè)置P值為0.05,利用ggplot2(3.4.0)函數(shù)將結(jié)果輸出為可視化圖形。

1.9 分子對(duì)接模擬 將與小柴胡湯活性成分直接相關(guān)的潛在靶標(biāo)導(dǎo)入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org),以尋找其3D結(jié)構(gòu)。利用AutoDock4.2(https://autodock.scripps.edu)和AutoDock Vina 1.2.0(https://vina.scripps.edu)軟件,根據(jù)已發(fā)表的方法對(duì)潛在靶標(biāo)及其對(duì)應(yīng)組分進(jìn)行分子對(duì)接模擬,對(duì)接結(jié)果由Pymol 2.5(https://pymol.org)進(jìn)行可視化。

一要注重本地資源與特色結(jié)合，從旅游六要素“吃、住、行、游、購(gòu)、娛”等方面開(kāi)展特色體驗(yàn)式旅游。吃江橋抗戰(zhàn)時(shí)期的食物，騎馬開(kāi)槍射擊增加實(shí)際感受。二要升級(jí)提高紀(jì)念館檔次，將以往的圖片展示和文物陳列通過(guò)高科技手段，三維立體地展現(xiàn)出來(lái)，增加感官效果，把江橋抗戰(zhàn)的文化內(nèi)容生動(dòng)展現(xiàn)出來(lái)。三要積極深入挖掘和豐富江橋抗戰(zhàn)文化的內(nèi)涵，營(yíng)造紅色旅游氛圍。通過(guò)虛擬現(xiàn)實(shí)技術(shù)，結(jié)合聲、光、電等現(xiàn)代手段，給游客以身臨其境的感覺(jué)。四要加強(qiáng)旅游紀(jì)念品的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)。如今游客旅游已經(jīng)不滿足于拍照合影，游客對(duì)旅游紀(jì)念品的關(guān)注度也在提高。旅游紀(jì)念品最能反映當(dāng)?shù)匚幕糜蝺?nèi)涵，所以積極探索打造內(nèi)涵深刻的江橋抗戰(zhàn)紀(jì)念品尤為重要。

2 結(jié)果

2.1 中藥化學(xué)成分的篩選結(jié)果 獲得柴胡有效化學(xué)成分17個(gè),半夏有效化學(xué)成分13個(gè),大棗有效化學(xué)成分29個(gè),甘草有效化學(xué)成分164個(gè),黃芩有效化學(xué)成分36個(gè),人參有效化學(xué)成分22個(gè),生姜有效化學(xué)成分5個(gè),可以作為作用于人體的有效活性物質(zhì)。見(jiàn)表1。

表1 小柴胡湯主要有效化學(xué)成分

2.2 活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過(guò)對(duì)上述有效成分的檢索,搜集對(duì)應(yīng)的人體靶蛋白,其中柴胡對(duì)應(yīng)人體183個(gè)靶點(diǎn),半夏對(duì)應(yīng)人體90個(gè)靶點(diǎn),大棗對(duì)應(yīng)人體194個(gè)靶點(diǎn),甘草對(duì)應(yīng)人體285個(gè)靶點(diǎn),黃芩對(duì)應(yīng)人體57個(gè)靶點(diǎn),人參對(duì)應(yīng)人體45個(gè)靶點(diǎn),生姜對(duì)應(yīng)人體50個(gè)靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape對(duì)結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,包含201個(gè)節(jié)點(diǎn)與589條邊,表明小柴胡湯治療乳腺癌是一個(gè)多成分、多靶點(diǎn)的整合調(diào)節(jié)的過(guò)程。見(jiàn)圖1。

圖1 中藥有效成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 為了識(shí)別與TNBC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因,進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,將軟閾值功率的最佳值設(shè)為5(圖2A)。根據(jù)基因間的共表達(dá)程度分為不同的模塊,將共表達(dá)基因的模塊設(shè)置為隨機(jī)顏色,其余基因設(shè)置為灰色模塊(圖2B)。模塊與乳腺癌不同亞型的相關(guān)關(guān)系如圖2C所示,其中紫色模塊是與TNBC亞型密切相關(guān)的,選擇紫色模塊進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)分析。

注:A.不同軟閾值下的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及平均連接度;B.加權(quán)基因共表達(dá)模塊樹(shù)狀圖;C.模塊與表型的相關(guān)性熱圖

2.4 TNBC相關(guān)基因的通路富集分析 提取上述紫色模塊的基因進(jìn)行富集分析來(lái)識(shí)別乳腺癌發(fā)生的關(guān)鍵生物功能與生物通路,其中這組基因在生物功能方面與細(xì)胞器裂變和細(xì)胞核分裂等細(xì)胞增殖過(guò)程密切相關(guān),在細(xì)胞組分方面與濃縮染色體和中心區(qū)核染色體密切相關(guān),在分子功能方面與單鏈DNA結(jié)合ATP依賴活性等相關(guān),通路富集分析結(jié)果表明,乳腺癌關(guān)鍵基因是精氨酸等代謝通路的關(guān)鍵因子。見(jiàn)圖3。

注:A.生物過(guò)程富集氣泡圖;B. 細(xì)胞組分富集氣泡圖;C.分子功能富集氣泡圖;D.通路功能富集網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 活性成分—靶點(diǎn)分析 將乳腺癌相關(guān)關(guān)鍵基因與小柴胡湯有效成分作用靶點(diǎn)取交集,獲得13個(gè)作用靶點(diǎn)(圖4A),作用的生物通路主要是谷胱甘肽代謝,和甘氨酸代謝通路(圖4B);進(jìn)一步進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn),小柴胡湯有效成分可以對(duì)生物過(guò)程,如p53類遞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和成纖維細(xì)胞增殖等進(jìn)行干預(yù)(圖4C),作用的細(xì)胞組分和分子功能主要是細(xì)胞周期蛋白—依賴蛋白激酶全酶復(fù)合體和細(xì)胞周期蛋白依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)活性(圖4D、圖4E)。

注:A.藥物靶點(diǎn)蛋白編碼基因與腫瘤靶點(diǎn)的交集韋恩圖;B.乳腺癌關(guān)鍵基因的通路富集網(wǎng)絡(luò)圖;C.生物過(guò)程富集氣泡圖;D.細(xì)胞組分富集氣泡圖;E.分子功能富集氣泡圖

注:A.核心靶點(diǎn)蛋白互作圖;B.核心成分度值樹(shù)狀圖

表2 核心基因度值

小柴胡湯中共有的槲皮素與山柰酚是小柴胡湯干預(yù)乳腺癌的關(guān)鍵因子。既往研究表明,癌細(xì)胞對(duì)槲皮素敏感,其敏感性取決于細(xì)胞系、暴露時(shí)間和槲皮素濃度。有研究[22]結(jié)果表明,山柰酚對(duì)癌細(xì)胞系有細(xì)胞毒性作用,可誘導(dǎo)不同濃度山柰酚處理的SCC-1483細(xì)胞凋亡。有研究者為了證實(shí)山柰酚對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用,還對(duì)SCC-25和SCC-QLL1等其他細(xì)胞系進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)山柰酚對(duì)所有腫瘤細(xì)胞系均有誘導(dǎo)凋亡作用。此外,還有研究[36]表明,山柰酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡依賴于Caspase-3的活性[23]。本研究在分子層面上觀察了槲皮素與山柰酚對(duì)腫瘤的影響,進(jìn)一步證實(shí)了小柴胡湯對(duì)TNBC的干預(yù)作用。最后,分子對(duì)接結(jié)果顯示,小柴胡湯中潛在活性成分與其關(guān)鍵靶點(diǎn)的良好結(jié)合力是由其結(jié)合位點(diǎn)處穩(wěn)定的氫鍵保證的,進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究靶點(diǎn)預(yù)測(cè)方法的可靠性。

表3 小柴胡湯活性成分度值

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 為了驗(yàn)證3個(gè)hub基因(CCNA2、CCNB1和CHEK1)與活性成分(槲皮素與山柰酚)是否直接相關(guān),利用AutoDock Vina對(duì)這3個(gè)潛在的靶蛋白及其對(duì)應(yīng)的小分子配體成分進(jìn)行分子對(duì)接模擬。結(jié)果顯示,3種核心蛋白與小分子化合物結(jié)合親和性較強(qiáng),證明小分子成分對(duì)靶標(biāo)具有良好的結(jié)合能力(見(jiàn)表4)。對(duì)接模擬中靶標(biāo)化合物的相互作用見(jiàn)圖6、圖7。

注:A.CCNA2-kaempferol復(fù)合物;B.CCNA2-quercetin復(fù)合物;C.CHEK1-kaempferol復(fù)合物;D.CHEK1-quercetin復(fù)合物;E.CCNB1-kaempferol復(fù)合物;F.CCNB1-quercetin復(fù)合物

注:A.CCNA2-kaempferol復(fù)合物;B.CCNA2-quercetin復(fù)合物;C.CHEK1-kaempferol復(fù)合物;D.CHEK1-quercetin復(fù)合物;E.CCNB1-kaempferol復(fù)合物;F.CCNB1-quercetin復(fù)合物

表4 對(duì)接復(fù)合物的結(jié)合自由能

3 討論

由于TNBC的侵襲性和缺乏可操作靶點(diǎn),長(zhǎng)期以來(lái)該病治療難度較大[8]。與其他亞型相比,其預(yù)后較差且中位總生存期不到2年[9]。綜合化學(xué)治療仍然是早期TNBC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,可以用來(lái)抑制腫瘤,并相應(yīng)地調(diào)整術(shù)后全身治療[10]。新輔助化學(xué)治療后,仍殘留有腫瘤的患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)極高[11-12]。對(duì)于晚期TNBC,目前尚缺乏有效治療手段,通常情況下使用靜脈化學(xué)治療來(lái)對(duì)患者的癌細(xì)胞以及轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷,從而破壞癌細(xì)胞的活性,并控制其轉(zhuǎn)移[13]。從臨床研究數(shù)據(jù)分析來(lái)看,化學(xué)治療雖然一定程度上對(duì)患者的癌細(xì)胞有殺傷作用,但同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)一定的毒性及不良反應(yīng),因此,需要通過(guò)更為合理的治療來(lái)達(dá)到“增效減毒”的效果。目前,臨床上常用小柴胡湯作為輔助用藥,以緩解化學(xué)治療給患者帶來(lái)的毒性及不良反應(yīng)[14]。小柴胡湯為《傷寒論》中的名方,方中柴胡苦平,透泄少陽(yáng)之邪,疏解肝郁,為君藥;黃芩苦寒,清泄少陽(yáng)之邪,為臣藥;佐以半夏、生姜和胃降逆止嘔;邪入少陽(yáng)則正虛,故以人參扶正祛邪,大棗益氣補(bǔ)脾;炙甘草助人參、大棗扶正祛邪,兼為佐使。

核心靶點(diǎn)CCNA2、CCNB1和CHEK1是與小柴胡湯成分直接對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn),通過(guò)代謝途徑分析,TNBC發(fā)生過(guò)程中甘氨酸和蘇氨酸代謝途徑被過(guò)度激活。Jain等[15]曾對(duì)NCI-60癌細(xì)胞株培養(yǎng)基的代謝物譜進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)甘氨酸消耗紊亂,與癌細(xì)胞增殖率相關(guān)。Hirayama等[16]報(bào)道了結(jié)腸癌和乳腺癌組織中氨基酸水平的升高。Mayers等[17]報(bào)道了人胰腺癌患者血清支鏈氨基酸水平升高。Chan等[18]還發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者尿液中丙氨酸含量升高。顯然,腫瘤組織或體液中氨基酸水平紊亂在乳腺癌患者中較為常見(jiàn)。氨基酸含量的增加可能是由于強(qiáng)烈的代謝造成的氧化應(yīng)激和細(xì)胞生長(zhǎng)所導(dǎo)致。另外,成纖維細(xì)胞激活蛋白α是絲氨酸蛋白酶家族中的一種同二聚整體膜明膠酶,在基質(zhì)室中被選擇性表達(dá)[19-20]。成纖維細(xì)胞激活蛋白α可對(duì)幾種人類惡性腫瘤的臨床結(jié)果產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[21]。

綜上,本研究采用生物信息學(xué)分析和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)小柴胡湯治療TNBC的分子作用機(jī)制進(jìn)行多途徑、多靶點(diǎn)研究,今后仍需要對(duì)小柴胡湯中關(guān)鍵成分抗TNBC的作用進(jìn)行驗(yàn)證。