基于JAK/STAT信號通路探討痰瘀同治法對糖尿病大鼠心肌病變的影響

陳 靜,儲全根,,儲 俊,軒 云,蔡正銀,李飛翔,羅寶璐,王悅琦

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室,安徽 合肥 230038)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是并發(fā)于糖尿病的獨立疾病,可引起心臟舒縮功能障礙、心肌肥厚、心肌纖維化,最終導(dǎo)致心力衰竭[1]。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)是一種多模式識別受體,屬于免疫球蛋白超家族,在高糖刺激下與晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)結(jié)合,激活多種相關(guān)信號通路,導(dǎo)致生長因子的轉(zhuǎn)錄和釋放增加,加重心肌炎癥及纖維化病變。酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus-activated kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信號通路對細(xì)胞增殖、分化、凋亡等具有重要作用[2],可通過調(diào)控趨化因子、黏附分子、生長因子等基因表達(dá)導(dǎo)致并加重DCM炎癥及纖維化病變[3]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一種炎癥因子,其不僅參與機體的炎癥反應(yīng),還與心肌纖維化及重構(gòu)、器官的慢性損傷等有關(guān)。課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn),痰瘀同治法對DCM大鼠心肌內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用,同時痰瘀同治法可有效干預(yù)糖尿病微血管病變[5]。為進(jìn)一步探究痰瘀同治法時DCM的作用機制,本實驗以具有化瘀功效的抵當(dāng)湯和具有化痰功效的小陷胸湯合方(抵當(dāng)陷胸湯)作為痰瘀同治法的代表方,觀察痰瘀同治法對DCM大鼠心肌組織JAK/STAT信號通路的影響。

1 材料

1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠55只,體質(zhì)量為(220±20)g,鼠齡約12周,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號:SCXK(皖)2020-001]。實驗嚴(yán)格按照安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心實驗動物保護(hù)與使用準(zhǔn)則進(jìn)行。在自然光照、濕度45%～55%、溫度25 ℃左右環(huán)境下飼養(yǎng)1周后進(jìn)行分組處理。本實驗獲安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批,批號: AHUCM-rats-2019014。

1.2 藥物 痰瘀同治組采用抵當(dāng)陷胸湯(全瓜蔞30 g,桃仁15 g,水蛭、虻蟲、制大黃、清半夏各10 g,黃連5 g);化痰組采用小陷胸湯(全瓜蔞30 g,清半夏10 g,黃連5 g);化瘀組采用血府逐瘀湯(桃仁12 g,紅花、當(dāng)歸、生地黃、牛膝各9 g,甘草、赤芍、枳殼各6 g,桔梗、川芎各4.5 g,柴胡3 g)。藥材采購于安徽中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院金傳山教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》[6]要求。煎煮方法:用10倍的水將中藥浸泡后,煎煮2次后將濾液合并,以文火煎煮藥液直到濃縮至含生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL,將濃縮后的藥液裝入瓶中,在-80 ℃冰箱冷凍后,制備凍干粉,保存?zhèn)溆?。阿拉氯?alagebrium chloride, ALT-711)由美國Med Chem Express公司生產(chǎn),每支50 mg,批號HY-106024B。

1.3 主要試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ;批號 S17049):美國Sigma公司;p-JAK1(貨號 bs-3238R,批號 AG11139224)、PPARγ(貨號 bs-4590R,批號 98080w)、TGF-β1(貨號 bs-0086R,批號 AD112007):北京博奧森生物技術(shù);RAGE(貨號 ab3611,批號 GR3191187-3)、p-STAT1(貨號 ab109461,批號 GR311501-5):英國Abcam公司;Tris(貨號 T8060,批號 1117W0713):北京索萊寶科技;PVDF膜(貨號 IPVH00010,批號 R8CA8257E):美國Millipore公司;Western一抗二抗去除液(貨號 P0025,批號 051418180626):上海碧云天生物技術(shù);β-actin(貨號 TA-09,批號 18AV0311):上海金畔生物科技;基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein,MMP9;貨號 JYM0434Ra,批號 GR2022-10)、纖連蛋白(fibronectin,FN;貨號 JYM0659Ra,批號 GR2022-10):武漢基因美科技。

1.4 主要儀器設(shè)備 RM2016切片機:德國徠卡;ACCU-CHEK Active血糖儀:德國羅氏;EPS300電泳儀:上海天能;CX41顯微鏡:日本OLYMPUS;PIKOREAL96熒光定量PCR儀:美國Thermo Scientific;RT-6100酶標(biāo)儀:深圳雷杜。

2 方法

2.1 模型復(fù)制 將55只健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,隨機選取10只作為空白組,剩余45只進(jìn)行模型復(fù)制。大鼠禁食不禁水12 h后,按55 mg/kg腹腔注射STZ溶液。72 h后,采用尾靜脈法測大鼠隨機血糖,若隨機血糖>16.7 mmol/L,則符合糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)[7]。前期研究[8-9]發(fā)現(xiàn),繼續(xù)飼養(yǎng)3周后大鼠心肌組織會呈現(xiàn)細(xì)胞肥大、心肌纖維斷裂并伴有炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變,提示DCM模型復(fù)制成功。

2.2 動物分組與給藥 將模型復(fù)制成功的40只大鼠用隨機數(shù)字表法分為模型組、化瘀組、化痰組、痰瘀同治組、ALT-711組。按照人與大鼠的給藥劑量換算系數(shù)[10]計算,空白組和模型組每日均按10 mL/kg蒸餾水灌胃;化瘀組、化痰組與痰瘀同治組每天分別以血府逐瘀湯(7.02 g/kg)、小陷胸湯(4.05 g/kg)、抵當(dāng)陷胸湯(8.10 g/kg)灌胃;ALT-711組以ALT-711 (3 mg/kg)灌胃。給藥8周后,采用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg進(jìn)行腹腔注射,大鼠麻醉后取心肌組織。

2.3 Western blot法檢測RAGE、PPARγ、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白表達(dá)水平 取凍存心肌組織50 mg,在冰上剪碎放入試管,加入RIPA細(xì)胞裂解液1 mL,離心后提取蛋白。上樣后,恒流轉(zhuǎn)膜(RAGE轉(zhuǎn)膜45 min,PPARγ轉(zhuǎn)膜60 min;p-JAK1轉(zhuǎn)膜140 min;p-STAT1轉(zhuǎn)膜90 min;TGF-β1轉(zhuǎn)膜60 min)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,參考一抗的說明書:RAGE、PPARγ、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1抗體屬性為兔抗,分別按照1∶1 000、1∶300、1∶300、1∶5 000、1∶1 000稀釋(10%分離膠),4 ℃緩慢搖動孵育過夜,洗3次,參考二抗的說明書,按照1∶10 000加入二抗稀釋液稀釋,室溫2 h后用JS-1070P自動曝光儀檢測RAGE、PPARγ、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白表達(dá)水平。

2.4 PCR法檢測RAGE、PPARγ基因的表達(dá)水平 將每組取出的凍存心肌組織50 mg倒入液氮研磨后,加入TRIzol總RNA抽提試劑1 mL,冰浴勻漿后,按說明書提取總RNA,每組取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;以β-actin為內(nèi)參,按照說明書進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性溫度為95 ℃,時間60 s;變性溫度95 ℃,時間20 s,退火溫度60 ℃,時間60 s,40個循環(huán)。計算方法是2-ΔΔCT。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 ELISA法檢測心肌組織FN、MMP9含量 取凍存的心肌組織,加入一定量的PBS,充分勻漿后離心,取上清液。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心肌組織中RAGE、PPARγ、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較 與空白組比較,模型組心肌組織中RAGE、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白表達(dá)水平均上升(P<0.05),PPARγ蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05);與模型組比較,化瘀組、化痰組、痰瘀同治組及ALT-711組心肌組織中RAGE、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白的表達(dá)水平均升高(P<0.05),PPARγ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與化瘀組和化痰組比較,痰瘀同治組RAGE、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05),PPARγ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2。

注:A.空白組;B.模型組;C.化瘀組;D.化痰組;E.痰瘀同治組;F.ALT-711組;

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與化瘀組比較,△P<0.05;與化痰組比較,◇P<0.05

3.2 各組大鼠心肌組織中RAGE、PPARγ基因表達(dá)水平比較 與空白組比較,模型組心肌組織中RAGE基因表達(dá)水平顯著上升(P<0.05),PPARγ基因表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,化瘀組、化痰組、痰瘀同治組及ALT-711組心肌組織RAGE基因表達(dá)水平顯著下降(P<0.05),PPARγ基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與化瘀組和化痰組比較,痰瘀同治組RAGE基因表達(dá)水平下降更顯著(P<0.05),而PPARγ基因表達(dá)水平升高更顯著(P<0.05)。見圖3。

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與化瘀組比較,△P<0.05;與化痰組比較,◇P<0.05

3.3 各組大鼠心肌組織中FN、MMP9含量比較 與空白組比較,模型組心肌組織FN、MMP9含量增加(P<0.05);與模型組比較,化瘀組、化痰組、痰瘀同治組及ALT-711組心肌組織FN、MMP9含量顯著下降(P<0.05);與化瘀組和化痰組比較,痰瘀同治組FN、MMP9含量下降更顯著(P<0.05)。見圖4。

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與化瘀組比較,△P<0.05;與化痰組比較,◇P<0.05

4 討論

DCM病理改變包括炎癥反應(yīng)、糖脂代謝紊亂和信號傳導(dǎo)異常等,這些會導(dǎo)致心肌肥大和心肌纖維化。RAGE是一種模式識別受體,在心肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞中表達(dá),RAGE具有多個配體,AGEs是RAGE重要的配體之一。JAK/STAT作為一種調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子基因的信號通路,被AGEs/RAGE激活后[11],磷酸化的JAK蛋白與STAT蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,結(jié)合靶基因的啟動子區(qū)域并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。JAK家族中有4種亞型,JAK1的過表達(dá)會激活STAT1并將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中調(diào)節(jié)基因表達(dá),參與纖維化病變[12]。STAT1可以通過調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)參與心肌纖維化過程[13],同時,p-STAT1還能引起高糖下心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原沉積[14]。JAK/STAT信號通路對DCM具有重要作用,抑制該通路可以改善DCM大鼠心肌纖維化,減輕炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激反應(yīng)[15-16]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠p-JAK1及p-STAT1蛋白表達(dá)增多,各用藥組p-JAK1及p-STAT1表達(dá)水平降低,提示DCM大鼠心肌JAK/STAT信號通路被激活,而痰瘀同治組下調(diào)效果較化痰組和化瘀組更為明顯,提示痰瘀同治法可以抑制JAK/STAT信號通路的表達(dá),效果優(yōu)于化痰組和化瘀組。PPARγ是一種與葡萄糖和脂肪酸代謝相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑,PPARγ能夠降血糖并提高胰島素的敏感性,目前已被用于治療糖尿病改善心肌纖維化。據(jù)報道,PPARγ可以抑制AGEs誘導(dǎo)的心肌纖維化[17],活化的PPARγ不僅能降低RAGE的活性[18],還能通過直接與STAT1結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄抑制性復(fù)合物,降低下游細(xì)胞因子的表達(dá)[19]。本研究結(jié)果顯示,各用藥組較模型組PPARγ表達(dá)水平升高,RAGE、p-JAK1、p-STAT1的表達(dá)水平降低,而痰瘀同治組效果較化痰組和化瘀組更明顯,提示痰瘀同治法可能通過活化PPARγ并下調(diào)RAGE的表達(dá)來抑制JAK/STAT信號通路,以保護(hù)心肌減輕損傷。

心肌纖維化的重要特征是細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。TGF-β1是重要的促纖維化因子,可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,改變心肌膠原的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[20]。FN是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,與心肌纖維化密切相關(guān),MMP9作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,其與抑制物的平衡被破壞會引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積,FN和MMP9表達(dá)會引起纖維化的發(fā)生,從而刺激TGF-β1增加FN、MMP9等表達(dá),加重纖維化病變[21-22]。

本研究結(jié)果顯示,模型組FN、TGFβ1、MMP9表達(dá)水平升高,而用藥后表達(dá)水平降低,其中痰瘀同治組下調(diào)更明顯,提示痰瘀同治法可降低FN、TGFβ1、MMP9表達(dá)水平,減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,減輕心肌纖維化病變。同時,JAK/STAT信號通路與MMP9、FN、TGFβ1等纖維化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)密切相關(guān)[13,23-24]。綜上,高糖狀態(tài)下,AGEs與RAGE結(jié)合后激活JAK/STAT信號通路,促進(jìn)TGF-β1、FN、MMP9的表達(dá),加重DCM病變,而痰瘀同治法通過抑制JAK/STAT信號通路,減少TGF-β1、FN、MMP9的表達(dá),減輕心肌纖維化病變。

DCM屬于中醫(yī)“消渴”伴有“胸痹”的范疇。發(fā)生DCM時,AGEs不斷積累并與其受體RAGE結(jié)合激活JAK/STAT通路,引起心肌微血管受損、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和纖維化等病理改變,同時這些改變亦進(jìn)一步導(dǎo)致AGEs的沉積。AGEs是由非酶反應(yīng)而生成的聚合物,具有“痰濁”特征,AGEs積累導(dǎo)致膠原蛋白沉積及纖維化等病理改變,又符合“瘀阻”特征[25],故形成“痰瘀互結(jié)”病機,“痰”與“瘀”相互交結(jié),難以獨除。正如《血證論》的描述:“有痰必有瘀,有瘀必有痰,痰阻血難行,血瘀痰難化?！笨梢娀岛突鲂柰瑫r施治,故本課題組以痰瘀同治法為防治思路,使用抵當(dāng)陷胸湯防治DCM。抵當(dāng)陷胸湯是由中抵當(dāng)湯與小陷胸湯合方而成,抵當(dāng)湯中水蛭、虻蟲同用共行破血逐瘀通絡(luò)之功,酒大黃、桃仁化瘀行血;小陷胸湯中黃連清熱燥濕、瀉火解毒,半夏化痰,二者相配辛開苦降,以全瓜蔞滌痰寬胸。本實驗結(jié)果表明,給藥8周以后,與模型組比較,化瘀組、化痰組、痰瘀同治組及ALT-711組RAGE、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1、FN、MMP9表達(dá)水平降低,而PPARγ的表達(dá)水平升高,提示各組對JAK/STAT信號通路及RAGE、TGF-β1、FN、MMP9有抑制作用,并活化PPARγ。痰瘀同治組較化痰組、化瘀組效果明顯,可見其對RAGE、p-JAK1、p-STAT1、TGF-β1、FN、MMP9表達(dá)水平的下調(diào)和對PPARγ的活化效果更明顯。本研究結(jié)果表明,痰瘀同治的抵當(dāng)陷胸湯通過抑制DCM大鼠JAK/STAT信號通路,減輕纖維化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá),改善DCM病變,且作用效果優(yōu)于單純的化痰組及化瘀組。

綜上所述,痰瘀同治法對DCM大鼠心肌病變具有保護(hù)作用,其機制可能與抑制JAK/STAT信號通路有關(guān),并且痰瘀同治法效果優(yōu)于單純的化痰和化瘀法。