基于NF-κB/AHR通路探討電針“足三里”和“內關”對腸易激綜合征大鼠內臟高敏感的調節機制

朱櫻芝,張 聰,李修靖,劉銘宇,葉曉榮,余 躍,

(1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院,安徽 合肥 230031;2.中國科學技術大學附屬第一醫院消化內科,安徽 合肥 230001)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種臨床常見的慢性功能性消化系統疾病[1],其癥狀主要表現為腹痛、腹脹和(或)腹部不適,且具備癥狀與排便相關,伴排便頻率和糞便性狀改變。腹痛是IBS常見癥狀之一,主要與內臟高敏感有關。內臟高敏感代表著傷害感受器興奮性的增加,后者通常與機械性擴張及炎癥相關的化學遞質有關[2]。

在多種細胞中,慢性疼痛總是伴隨著活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生。Vaculin等[3]研究表明,ROS或參與內臟高敏感的發生。核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AHR)通路可通過NF-κB與AHR之間的交互作用促進AHR信號傳導,誘導細胞色素P1(cytochrome P1,CYP1)等基因表達,從而調控ROS的形成[4-5]。有研究[6-8]表明,輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)參與IBS的免疫調節機制并高水平表達AHR,其特征是產生細胞因子白細胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)。此外,有研究[9]發現,使用AHR激動劑可以降低IL-17A的合成,從而減輕腸道炎癥,核AHR復合體結合的核心核苷酸序列也在IL-17A中表達。這些研究結果提示,NF-κB、AHR、CYP1、IL-17A可能與IBS相關,但其與內臟高敏感之間的作用機制尚不明確。

針刺治療消化道疾病有著悠久的歷史。近年來臨床研究[10]發現,電針能有效緩解IBS的癥狀,但其作用機制仍不明確。足三里和內關穴常用于治療胃腸疾病。本研究旨在基于內臟高敏感機制探討電針“足三里”和“內關”對IBS大鼠NF-κB、AHR、CYP1、IL-17A蛋白表達的影響,為臨床治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 4只健康SD孕鼠,適應性喂養至孕鼠生產,購于安徽醫科大學實驗動物中心[生產許可證號:SCXK(皖)2017-001],飼養于安徽省立醫院實驗動物房?？刂剖覂葴囟葹?2～25 ℃,保持濕度為40%～60%。晝夜時間各為12 h,普通飲食飲水。置于安靜、避光環境。每日定時喂食、喂水,定時更換大鼠墊料和飲水器。

1.2 試藥 乙酸:美國Sigma公司;ELISA試劑盒(貨號 JER-09):安徽巧伊生物公司;AHR抗體(貨號 67785-1-lg,1∶700):武漢三鷹生物技術有限公司;CYP1抗體(貨號 820518,1∶700):成都正能生物技術有限公司;NF-κB P65抗體(貨號 250021,1∶700):成都正能生物技術有限公司;action-β抗體(貨號 GB12001,1∶2 00 0):Servicebio。

1.3 儀器 長城牌KWD-8081脈沖電針儀:武進市長城醫療器械有限公司;垂直電泳儀BV-2:武漢Servicebio公司;酶標儀RT-6100:美國Rayto公司;臺式高速冷凍離心機D3024R:北京Dragonlab公司。

2 方法

2.1 IBS大鼠模型制備及分組 大鼠出生后第8天,將40只雌雄各半的新生SD大鼠隨機分為模型制備組(n=32)和空白組(n=8),模型制備組大鼠出生后第8～21天給予“母嬰分離結合醋酸灌腸”的方法[11]制備IBS大鼠模型:幼年大鼠出生后第2～21天每日進行3 h母子分離;幼年大鼠出生后第8天起,將經石蠟潤滑后直徑為1 mm的中心靜脈導管緩慢插入幼鼠肛門約2 mm處,給予0.2 mL 0.5%醋酸灌腸,每隔2 d增加0.1 mL,增至0.5 mL后維持灌注量至大鼠出生第21天?？瞻捉M給予相同容積的生理鹽水。第22天起正常飼養至第6周。對模型復制后的各組大鼠進行腹壁回撤反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)評分,以3～4分為模型復制成功的標準。模型復制過程中死亡3只,模型構建失敗5只。將模型復制成功的IBS大鼠隨機分為模型組、假刺激組、電針組,每組8只。

2.2 干預方法 電針組大鼠取同側“足三里”和“內關”穴,足三里穴直刺7 mm,“內關”穴直刺2 mm,將電針儀的輸出線正負極分別接在兩穴針柄上,電針參數:電流1 mA,疏密波,頻率為2/15 Hz,以針柄輕顫為度進行刺激;每次電針30 min,隔日1次,共干預4周。假刺激組僅電刺激非經非穴部位(“足三里”及“內關”穴旁開5 mm處),空白組及模型組僅抓取,不做其他干預。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 大鼠一般情況、體質量及糞便性狀評分 每周觀察大鼠精神狀態、皮毛色澤、活動情況、糞便性狀并記錄大鼠體質量。大鼠治療前后糞便性狀根據Bristol糞便分型[12]進行評分。分離硬團、堅果樣糞便,計1分;成塊、臘腸樣糞便,計2分;臘腸樣糞便,但水分較少,表面有裂痕,計3分;臘腸樣或蛇樣糞便,柔軟光滑,計4分;軟團塊狀糞便,邊緣清楚,計5分;糊狀或松散碎片狀糞便,邊緣不清,計6分;水樣便,無固狀物,計7分。分數越高表示腹瀉越嚴重。

2.3.2 AWR評分及內臟痛閾值

(1)AWR測定及評分[13]測量前24 h禁食但不禁水。腹腔注射10%水合氯醛(20 mg/kg)麻醉大鼠后,放入自制的大鼠固定器中,使其只能上下運動,無法前后活動及轉身,將涂抹石蠟油的球囊導管輕柔插入大鼠肛門,使球囊末端距肛門約1 cm,并用膠帶將導管與鼠尾根部固定。待大鼠清醒并能適應環境后,向球囊內迅速注水,并停留30 s。AWR評分標準:大鼠活動如常且無明顯疼痛反應,計0分;刺激期間大鼠動作突然停頓并伴有頭部運動行為,計1分;刺激期間大鼠動作停頓并伴有腹直肌收縮,計2分;大鼠腹部抬起但無弓背行為,計3分;大鼠身體明顯拱起,并伴有盆腔抬高與陰囊收縮,計4分。

(2)內臟痛閾值 將大鼠放入固定器中并插入球囊導管,向球囊內緩慢注水,注水量從0.1 mL開始,每次勻速遞增0.1 mL,直至0.5 mL,每次擴張持續30 s以觀察大鼠的反應。待大鼠安靜1 min 后,反復多次加壓直至大鼠腹部抬起和背部拱起(即AWR評分為3 分)時的最低注水量作為內臟痛閾值。

2.3.3 ELISA法檢測大鼠血清IL-17A水平 收集大鼠血液,3 000 r/min離心10 min,分離血清。將50 μL標準品和樣品分別加入對應孔中,再加50 μL抗體Cocktail,室溫孵育2 h。洗滌10 s,共3次。加入100 μL TMB Development Solution避光孵育10 min。加入100 μL終止液,1 min后在A450nm處讀數。具體步驟參照ELISA試劑盒說明書。

2.3.4 Western blot法檢測大鼠結腸組織中AHR、CYP1、NF-κB P65蛋白表達水平 以頸椎脫臼法處死大鼠,取結腸組織,采用Western blot法檢測組織中AHR、CYP1、NF-κB P65蛋白的表達水平,具體步驟參照試劑盒說明書。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況、糞便性狀評分及體質量比較 與空白組比較,模型制備組大鼠精神萎靡,皮毛暗淡無華,少動喜蜷縮,糞便稀軟,飲食減少,體質量增長緩慢。電針組治療后,精神較前有所好轉,皮毛光澤順滑,溏泄程度減輕,體質量較前增加。與空白組比較,模型組大鼠糞便性狀評分顯著增加(P<0.05),說明模型復制后大鼠糞便趨向稀便。與模型組比較,電針組大鼠糞便性狀評分顯著減少(P<0.05),說明電針治療可以改善大鼠糞便性狀。與空白組比較,模型組大鼠體質量顯著下降(P<0.05);與模型組比較,電針組大鼠體質量顯著增加(P<0.05)。見圖1。

3.2 各組大鼠內臟痛閾值比較 與空白組比較,模型組大鼠內臟痛閾值顯著降低(P<0.05),說明模型組大鼠內臟敏感性增加;與模型組比較,電針組大鼠內臟痛閾值顯著增加(P<0.05),說明電針治療后,大鼠內臟敏感性降低。見圖2。

3.3 各組大鼠血清IL-17A水平比較 與空白組比較,模型組大鼠血清IL-17A水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,電針組大鼠血清IL-17A水平顯著降低(P<0.05)。結果表明,電針治療可能通過降低IL-17A的水平減輕大鼠內臟的高敏感性。見圖2。

注:A.空白組;B.模型組;C.假刺激組;D.電針組;與空白組比較,*P<0.05,與模型組比較,#P<0.05

3.4 各組大鼠結腸組織AHR、CYP1、NF-κB P65蛋白表達水平比較 與空白組比較,模型組大鼠結腸組織AHR、CYP1、NF-κB P65蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,電針組大鼠結腸組織AHR、CYP1、NF-κB P65蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)。見圖3。

注:與空白組比較,*P<0.05,與模型組比較, P<0.05

4 討論

IBS是一種臨床常見的功能性疾病,藥物的治療效果不佳。電針作為一種無創、不良反應小的治療手段,在臨床上具有一定的優勢。目前,臨床研究大多聚焦于電針不同穴位的療效差異,以及通過不同的療效指標評價電針的治療效果。如高紡等[14]發現,針刺可以提高便秘型IBS大鼠小腸推進率;Pei等[15]研究發現,電針治療能顯著降低腹瀉型IBS患者內臟對結直腸擴張的敏感性;Wu等[16]發現,電針可緩解IBS大鼠內臟高敏感并降低下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素水平。

足三里穴是胃的下合穴、足陽明胃經的合穴。《四總穴歌》云:“肚腹三里留?！贬槾套闳镅梢孕袣庵雇?、疏通經絡、調理胃腸功能紊亂等。冉國平等[17]發現,電針足三里可以通過抑制NF-κB通路相關基因的表達來改善胃腸功能的紊亂?！皟汝P”穴是手厥陰經絡穴,與三焦經相絡,也是八脈交會穴之一,能調節十二經脈氣血運行,主治心胸胃脘病證,可以改善IBS的精神系統癥狀以及胃腸系統疾病。本研究結果顯示,電針“足三里”穴和“內關”穴可以使大鼠的內臟痛閾值升高,這表明在相同容量刺激下,IBS大鼠內臟敏感性降低。同時,通過對比電針組和模型組大鼠的Bristol糞便性狀評分可以發現,經電針刺激后的大鼠糞便性狀評分更趨向于空白組,表示通過電針刺激可以改善IBS大鼠腹瀉癥狀。

NF-κB/AHR通路可能是低度炎癥致內臟高敏感的通路機制之一。國內研究[18]發現,NF-κB在艾灸改善腹瀉型IBS低度炎癥反應中具有重要作用。NF-κB是一種重要的核內轉錄因子,P65是NF-κB的關鍵亞基之一。活化的NF-κB可與基因中κB序列發生特異性結合,進入核內起始轉錄,啟動和調節相關炎癥因子的表達,加劇腸道炎癥反應[19]。AHR信號與NF-κB家族之間存在明顯串擾,AHR似乎能激發促炎或抗炎功能,并增強或抑制組織中NF-κB活性[19-20]。Xu等[20]發現,黃酮類苦參素通過AHR可以調節巨噬細胞的功能來減輕IBS的癥狀。因此推測,NF-κB/AHR通路可能是治療IBS的一種有效途徑。在本實驗中,模型組大鼠結腸組織AhR、CYP1、NF-κB P65蛋白表達水平較空白組降低,這可能是導致IBS大鼠內臟敏感性增高的原因,同時電針組大鼠結腸組織AHR、CYP1、NF-κB P65蛋白表達水平回升,提示電針可通過NF-κB/AHR通路減少低度炎癥,從而對IBS大鼠起到治療作用。此外,研究發現在Th細胞亞群中,Th17細胞高水平表達AHR,Th17產生的IL-17A可通過促進細胞因子等多種炎癥遞質參與炎癥的過程,并對維持黏膜屏障等有保護作用[21],IL-17A參與了腸道的炎癥過程[22]。Long等[8]發現,感染后的IBS中腸道固有層樹突狀細胞內吞能力減弱主要是由于Th17免疫應答導致的。IL-17A的表達水平可以反映AHR是否被激活及與腸道炎癥之間的關系。本研究結果顯示,電針組大鼠血清IL-17A水平較模型組顯著降低,這可能是IL-17A可以改善腸道炎癥、降低內臟高敏感的證據之一。

綜上所述,本研究采用電針“足三里”和“內關”穴治療IBS大鼠,通過檢測大鼠內臟痛閾值、血清IL-17A水平及NF-κB/AHR通路相關蛋白的表達,發現經電針治療后IBS大鼠內臟痛閾值較模型組顯著上升,IL-17A水平較模型組顯著降低,NF-κB P65、AHR、CYP1的表達水平較模型組顯著增加,故筆者推測電針“足三里”和“內關”穴可通過激活NF-κB/AHR通路下調IL-17A,從而改善IBS大鼠的內臟高敏感,緩解IBS大鼠腹痛、腹瀉等不適癥狀。