基于柔性微弦的微組織纖維化力學(xué)測(cè)量裝置*

徐樂(lè)樂(lè),鄧林紅△,王翔△

(1.常州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院,常州 213164;2.常州大學(xué) 藥學(xué)院,常州 213164;3.常州大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,常州 213164)

0 引言

纖維化是一種組織因損傷或發(fā)生炎癥而硬化和結(jié)疤的病理現(xiàn)象,主要特征是組織基質(zhì)過(guò)度生長(zhǎng)、硬化和形成瘢痕,可導(dǎo)致功能障礙,并損害人體的重要器官,包括肝臟、肺、腎臟和皮膚[1-2]。其發(fā)病機(jī)制主要由于損傷導(dǎo)致成纖維細(xì)胞持續(xù)分化為肌成纖維細(xì)胞[3-5],后者表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA),并大量沉積于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)所致[6-7]。近年來(lái),纖維化疾病的發(fā)病率及與纖維化相關(guān)的死亡人數(shù)逐漸上升。然而,目前市場(chǎng)獲批的抗纖維化藥物較少且不能阻止疾病進(jìn)展[8-9]。因此,迫切需要建立新的檢測(cè)模型用于抗纖維化藥物篩選。

目前,將二維培養(yǎng)細(xì)胞陣列配置成高通量的格式,已廣泛用于抗纖維化藥物的分子機(jī)制研究中[2,10-11],但其無(wú)法真實(shí)反映纖維化所處的復(fù)雜三維細(xì)胞微環(huán)境。因此,無(wú)法滿(mǎn)足抗纖維化藥物篩選的特殊要求。早期研究試圖從不同器官制備的組織切片中保留較好的組織特征,但模型的低可靠性限制了其在抗纖維化藥物評(píng)估中的應(yīng)用[12-13]。此外,通過(guò)測(cè)量肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)三維膠原的宏觀收縮已被用作抗纖維化篩選的一種表型參數(shù)[14-15]。然而,該方法缺乏形態(tài)學(xué)控制和有效量化分析指標(biāo),導(dǎo)致預(yù)測(cè)藥物療效的能力和準(zhǔn)確性有限。目前,一般通過(guò)測(cè)量肌成纖維細(xì)胞分化標(biāo)志物α-SMA水平、TGF-β依賴(lài)性基因表達(dá)或ECM蛋白豐度來(lái)評(píng)估抗纖維化藥物[16-17]。然而,由于體內(nèi)纖維化的復(fù)雜性,這些測(cè)定往往只反映纖維化進(jìn)程中的單一分子事件,無(wú)法綜合反映待測(cè)藥物對(duì)纖維化的作用[18-19]?？紤]到肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的收縮力作用于ECM并最終導(dǎo)致組織致密化,本研究建立了一種基于膠原(纖維化組織中主要的ECM蛋白)包埋成纖維細(xì)胞的自由收縮三維微組織模型。該模型可快速致密,以模擬纖維化組織的形成。通過(guò)結(jié)合已開(kāi)發(fā)的基于微弦的力傳感器[20],本研究測(cè)量了微組織纖維化過(guò)程中的收縮力變化,并定量分析了上皮細(xì)胞及其產(chǎn)物前列腺素E2對(duì)微組織致密化和收縮力的抑制作用。結(jié)果顯示,該方法在三維培養(yǎng)環(huán)境中成功測(cè)量了纖維化微組織的收縮力。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

I型鼠尾膠原(Advanced Biomatrix公司);Sylgard 184(Dow Corning公司);鬼筆環(huán)肽(Af647-Phalloidin);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、三氯硅烷(1H,1H,2H,2H- Perfluorooctane);杜氏改良培養(yǎng)基(Duchenne's modified medium,DMEM)、硅脂 (Baysilone公司);青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶(Gibco公司);小鼠單克隆抗體(α-SMA,博士德生物工程有限公司);纖連蛋白兔克隆抗體(Abcam公司);Alexa Fluor488 Donkey-ANTI-Mouse、Alexa Fluor488 Donkey-ANTI-Rabbit(Thermo公司);前列腺素(E2,Sigma公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司);激光共聚焦顯微鏡(LSM 710,Zeiss公司);活細(xì)胞工作站(Cell observer,Zeiss公司);精密天平(賽多利斯公司);三維電動(dòng)顯微操作系統(tǒng)(InjectMan NI2,Eppendorf公司);等離子清洗機(jī) (Potentlube PT-5S,深圳三和波達(dá)機(jī)電科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1聚二甲基硅氧烷微弦的制備 采用深度反應(yīng)離子蝕刻技術(shù)制備微弦的硅模具(蘇州汶顥微流控技術(shù)股份有限公司)。將固化劑和Sylgard 184(1∶10比例)的混合物澆鑄在硅模具上,經(jīng)80 ℃固化4 h后得到聚二甲基硅氧烷(PDMS)反模,包括兩個(gè)平行、含有鋸齒結(jié)構(gòu)的微槽(高50 μm、寬100 μm、長(zhǎng)15 mm,間隔1 000 μm)。PDMS反模表面經(jīng)氧等離子體處理后,涂覆1%聚乙烯醇/水。干燥后,將未固化的PDMS填充到PDMS反模的微槽中。使用未固化的PDMS作為粘合劑,將矩形PDMS塊(高2 mm)固定在兩端,在80 ℃下固化4 h。然后,將一直徑為22 mm的玻璃蓋玻片與兩個(gè)PDMS塊粘在一起。將該裝置浸入水中溶解PVA涂層,使微弦從PDMS反模中脫離。最后將圓形PDMS支架(直徑3 mm,高1.5 mm)粘在微弦中心區(qū)域下方的玻璃蓋上。

1.2.2微弦彈性系數(shù)的測(cè)量 微弦的力學(xué)表征和力學(xué)仿真已有詳細(xì)描述[20],本研究通過(guò)直接測(cè)量一定載荷下微弦的撓度來(lái)表征微弦的彈性系數(shù)。將裝有微弦的裝置水平放置在電子分析天平上,使用微操控系統(tǒng)對(duì)微弦中心部位施加垂直壓力。以20 μm為步進(jìn)距離,記錄天平質(zhì)量讀數(shù)及相應(yīng)的微弦撓度(D)。將天平質(zhì)量讀數(shù)(mg)轉(zhuǎn)換為力(μN(yùn))后,得到微弦撓度-應(yīng)力曲線。根據(jù)胡克定律,計(jì)算彈性系數(shù)。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和微組織的構(gòu)建 NIH/3T3成纖維細(xì)胞(7-12代)、MLE 12小鼠肺泡上皮細(xì)胞以及MDCK犬腎細(xì)胞均培養(yǎng)于高糖DMEM(添加10% FBS)中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。

使用硅脂將微弦底部粘到12孔培養(yǎng)板的基底上,以避免設(shè)備在長(zhǎng)期成像期間漂移。將培養(yǎng)的NIH/3T3細(xì)胞胰蛋白酶化,然后與中和后的鼠尾I型膠原蛋白與密度為106個(gè)成纖維細(xì)胞/mL的濃度為2 mg /mL膠原蛋白溶液混合。將8 μL的細(xì)胞膠原混合液播種在微弦中心,在培養(yǎng)箱中放置40 min聚合。12孔培養(yǎng)板每孔充1.8 mL新鮮培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中孵育至96 h,或安裝在顯微鏡上定時(shí)成像。

為進(jìn)行上皮細(xì)胞與微組織共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),微組織在培養(yǎng)箱聚合40 min后,將MDCK細(xì)胞和MLE 12 細(xì)胞(8 ×106細(xì)胞,5 μL)懸浮液分別滴在聚合的NIH/3T3細(xì)胞和膠原蛋白混合物上,使細(xì)胞液滴包裹在NIH/3T3-膠原混合物外部,然后在培養(yǎng)孔底部加入200 μL培養(yǎng)基以保持濕度,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min后,每孔補(bǔ)充1.8 mL新鮮培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中或安裝在顯微鏡上成像。藥物處理時(shí),在培養(yǎng)板的單孔中加入200 μL預(yù)先加熱的含有該藥物的培養(yǎng)基。本研究使用的藥物和劑量為前列腺素E2(PGE2, 1 μM, 10 μM , 100 μM)。

1.2.4微組織活細(xì)胞成像與免疫熒光成像 熒光倒置顯微鏡同時(shí)對(duì)12孔板內(nèi)的多個(gè)微組織進(jìn)行活細(xì)胞成像。使用ORCA-Flash 4.0相機(jī)(日本濱松)和5×/0.16 NA物鏡進(jìn)行定時(shí)成像(1 h/幀)。

為進(jìn)行微組織α-SMA和纖連蛋白(Fibronectin)免疫熒光染色,微組織培養(yǎng)72 h后,進(jìn)行固定、通透化和封閉處理。α-SMA 、FN一抗4 ℃冰箱孵育16 h使用。使用PBS洗滌3次,每次持續(xù)10 min,Alexa Fluor488 Donkey -ANTI-Mouse、Alexa Fluor488 Donkey -ANTI-Rabbit二抗室溫孵育4 h。再用結(jié)合Alexa Fluor Plus 647的鬼筆環(huán)肽(phalloidin-AF647)與DAPI對(duì)F-actin和細(xì)胞核室溫避光染色3 h,最后使用PBS洗滌3次,每次持續(xù)10 min。用Zeiss 710共聚焦顯微鏡于10×/0.3 NA或20×/0.5 NA物鏡下對(duì)微組織進(jìn)行3D成像,通道分別選取綠色(488 nm)、紅色(633 nm)和藍(lán)色(405 nm)。

1.2.5微組織收縮力的計(jì)算 對(duì)完全固定在兩個(gè)微弦上的微組織進(jìn)行定量分析。使用Image J測(cè)量微弦中點(diǎn)內(nèi)側(cè)的間距。將培養(yǎng)第1 h測(cè)定的間距設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)d0,待測(cè)時(shí)間點(diǎn)微弦間距為dt,弦間距變化量Δd=(d0-dt)/2。根據(jù)胡克定律,微組織產(chǎn)生的收縮力F= Δd×k。使用SPSS進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.01即認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微弦力學(xué)傳感器的制備和纖維化微組織模型的建立

本研究采用PDMS微弦結(jié)構(gòu)作為檢測(cè)纖維化微組織收縮力的傳感器。對(duì)制備的微弦結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行形態(tài)表征和力學(xué)表征。該裝置由兩根長(zhǎng)為15 mm的微弦構(gòu)成,該平行微弦的兩端固定于兩個(gè)長(zhǎng)方形PDMS塊,見(jiàn)圖1(a)。該P(yáng)DMS微弦結(jié)構(gòu)帶有鋸齒,可錨定微組織,防止其產(chǎn)生橫向收縮,見(jiàn)圖1(b)。將制備批次不同的微弦裝置進(jìn)行寬度、間距和高度的測(cè)量,證實(shí)其無(wú)顯著性差異,確保力學(xué)測(cè)量的可重復(fù)性,見(jiàn)圖1(c)。PDMS聚合物具有良好的彈性性能,可在μN(yùn)級(jí)作用力下產(chǎn)生形變。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定,微弦所受應(yīng)力載荷與其撓度變化呈線性關(guān)系,見(jiàn)圖1(d)。因此,根據(jù)胡克定律,計(jì)算其彈性系數(shù)k=0.083 μN(yùn)/μm,結(jié)合顯微鏡的光學(xué)分辨率,可獲得較高的力學(xué)靈敏度(100 nN)。此外,當(dāng)15 mm長(zhǎng)的微弦達(dá)到 500 μm 的最大偏轉(zhuǎn)撓度時(shí),其拉伸應(yīng)變僅增加了 0.2%,保證了其力學(xué)穩(wěn)定性。同時(shí),長(zhǎng)為15 mm微弦裝置保證了該傳感器較高的線性測(cè)量范圍(0～25 μN(yùn))。

圖1 微弦的幾何及力學(xué)表征

當(dāng)細(xì)胞膠原團(tuán)接種到微弦中央位置后,在37 ℃ 環(huán)境中,膠原蛋白逐漸固化,使混合物錨定于微弦上。圖2(a)為致密組織的形成,紅線顯示微弦間距。由圖2(a)可知,隨培養(yǎng)時(shí)間增加,混合物持續(xù)收縮并逐漸形成致密微組織,導(dǎo)致兩根微弦間距離減少。纖維化組織的收縮和致密化由肌成纖維細(xì)胞驅(qū)動(dòng),因此,肌成纖維細(xì)胞的α-SMA蛋白是纖維化的重要標(biāo)志。故此,本研究首先利用免疫熒光技術(shù)分析了微組織培養(yǎng)72 h后α-SMA蛋白的表達(dá)水平。共聚焦成像顯示,NIH/3T3細(xì)胞中α-SMA大量表達(dá)(見(jiàn)圖2(b)),表明在該微組織模型中,NIH/3T3細(xì)胞在無(wú)外源性TGF-β刺激的情況下,分化為肌成纖維細(xì)胞。本研究隨后對(duì)纖維化過(guò)程中的ECM沉積進(jìn)行觀察。免疫熒光顯示,纖連蛋白(fibronectin)在微組織中有較高水平的表達(dá),見(jiàn)圖2(c)。通過(guò)對(duì)纖維化標(biāo)志性蛋白的觀察證實(shí),NIH/3T3細(xì)胞和膠原混合物可在微弦上形成纖維化微組織。

圖2 微組織致密化及主要纖維化標(biāo)志物蛋白的表達(dá)

2.2 微組織纖維化過(guò)程中的力學(xué)測(cè)量

微組織纖維化過(guò)程中,體積顯著縮小,透光率也隨之降低,見(jiàn)圖2(a)。為定量分析其致密化水平,本研究測(cè)量了微組織圖像的灰度變化。由圖3(b)可知,微組織致密化程度在培養(yǎng)24 h后顯著上升,并在48 h后趨于穩(wěn)定。為檢測(cè)微組織纖維化過(guò)程中的收縮力,本研究測(cè)量了不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)微弦的間距(即圖2(a)的紅線)。由圖3(a)、(c)可知,微組織的持續(xù)收縮導(dǎo)致兩根微弦間的位移逐漸減小,96 h后約縮至起始間距的50%。結(jié)合微弦彈性系數(shù),計(jì)算可得該培養(yǎng)期間纖維化微組織收縮力,發(fā)現(xiàn)其隨培養(yǎng)時(shí)間而持續(xù)增加。72 h后,收縮力趨向穩(wěn)定,可達(dá)(13.1±0.4) μN(yùn)。該現(xiàn)象說(shuō)明微組織致密化穩(wěn)定后(48 h),其內(nèi)部收縮力依然持續(xù)增大直至趨于穩(wěn)定,同時(shí)也證實(shí)本力學(xué)測(cè)量系統(tǒng)比形態(tài)學(xué)觀察更加靈敏。

圖3 微組織纖維化過(guò)程中的力學(xué)變化

2.3 細(xì)胞或藥物抑制纖維化導(dǎo)致微組織收縮力下降

除收縮性成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞外,非收縮性上皮細(xì)胞也參與調(diào)節(jié)纖維化過(guò)程[21]。為探究上皮細(xì)胞在纖維化過(guò)程中如何調(diào)控微組織收縮力,本研究在微弦上構(gòu)建上皮細(xì)胞-微組織共培養(yǎng)體系。當(dāng)小鼠肺泡上皮細(xì)胞(MLE 12)和犬腎細(xì)胞(MDCK)兩種上皮細(xì)胞分別于微組織共培養(yǎng)時(shí),微組織的致密化受到了顯著抑制,見(jiàn)圖4(a)。通過(guò)測(cè)量微弦間距的變化,發(fā)現(xiàn)兩種上皮細(xì)胞均對(duì)微組織收縮力產(chǎn)生了抑制作用,其中,MDCK細(xì)胞的抑制效果最為顯著,見(jiàn)圖4(a)右。該結(jié)果證實(shí)上皮細(xì)胞可通過(guò)抑制微組織的收縮力而延緩其致密化進(jìn)程。

圖4 細(xì)胞或藥物抑制纖維化微組織的收縮力

為模擬抗纖維化藥物篩選,本研究使用前列腺素E2(PGE2)驗(yàn)證該纖維化微組織收縮力的測(cè)量模型。健康上皮細(xì)胞通過(guò)PGE2信號(hào)通路抑制成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變(FMT)[22-23]。分別用1、10、100 μM三種不同濃度的PGE2處理微組織至96 h,并測(cè)量微弦間距。由圖4(c)可知,不同濃度PGE2處理后微組織的致密化水平呈現(xiàn)明顯差異。當(dāng)PGE2濃度高于10 μM時(shí),其對(duì)微組織的收縮力產(chǎn)生了顯著的抑制效應(yīng),見(jiàn)圖4(d)。上述結(jié)果證明,該力學(xué)測(cè)量裝置可用于抗纖維化藥物篩選及濃度梯度測(cè)試。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)10 μM PGE2產(chǎn)生的抑制效果與MDCK細(xì)胞相當(dāng),表明該濃度可能是上皮細(xì)胞維持抗纖維化活性所需的PGE2有效水平。

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究在微弦力學(xué)傳感器上構(gòu)建了基于NIH/3T3細(xì)胞的纖維化微組織模型,通過(guò)原位實(shí)時(shí)成像研究微組織纖維化過(guò)程中的形態(tài)和力學(xué)變化。與以往研究纖維化模型需要加入外源性TGF-β刺激形成相比,本研究微組織模型在無(wú)外源TGF-β條件下,培養(yǎng)72 h后即自發(fā)開(kāi)始纖維化,表現(xiàn)為肌成纖維細(xì)胞分化的關(guān)鍵蛋白表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。這可能是由于微組織致密化進(jìn)一步刺激肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β,從而增強(qiáng)肌成纖維細(xì)胞的激活[24-26]。這種正反饋機(jī)制使得該微組織成為不依賴(lài)于TGF-β的快速纖維化模型。細(xì)胞的收縮力是生物組織纖維化致密化的主要物理驅(qū)動(dòng)力。本研究成功測(cè)得上皮細(xì)胞及抗纖維化分子對(duì)纖維化組織收縮力的抑制作用,一方面表明組織收縮力是評(píng)估纖維化進(jìn)程的理想量化指標(biāo),另一方面驗(yàn)證了該微弦系統(tǒng)作為抗纖維化藥物評(píng)測(cè)工具的可行性。因此,結(jié)合了靈敏微弦力傳感器的微組織模型有望為抗纖維化藥物評(píng)估和篩選系統(tǒng)的開(kāi)發(fā),以及探索纖維化疾病的病理機(jī)制提供參考。