細胞內鉀離子穩態測量技術及其調控機制研究進展

顏芷昕 宋娜娜，3 丁小強△

（1復旦大學附屬中山醫院腎內科 上海 200032； 2上海市腎病與血液透析重點實驗室 上海 200032；3復旦大學張江研究院 上海 200120）

維持機體鉀平衡是保證多種生命活動正常運行的必要條件，鉀平衡紊亂會導致多系統、多器官的異常，機體鉀缺乏可促心血管疾病［1］、慢性腎臟病［2］的發生和發展。臨床上一般用血鉀和尿鉀水平來評估機體鉀的平衡狀態，這些指標主要反映細胞外液鉀離子水平。然而，越來越多的研究提示細胞外液鉀離子濃度不夠靈敏和真實地反應機體鉀水平，如長期低鉀飲食可使血鉀濃度依舊接近正常值，但此時機體的低鉀狀態已造成腎損傷指標的升高［3］，因此需要一個更真實更靈敏的指標反映機體鉀水平——細胞內鉀離子濃度可能更為合適。鉀離子在細胞內外并非呈均衡分布，細胞內液鉀離子濃度（150 mmol/L）約是細胞外液（3.5～5 mmol/L）的30倍［4］。在慢性腎臟病的模型中，盡管此時的血鉀濃度可能并無明顯改變，但細胞內鉀離子濃度明顯減少，及時糾正細胞內低鉀的情況可改善細胞周期阻滯及腎臟纖維化［5］，細胞內液鉀離子可能作為細胞外液的緩沖系統，較細胞外液先發生平衡紊亂，因此細胞內液鉀離子水平更靈敏地反映機體鉀狀態。此外，維持細胞內鉀離子穩態可調節能量代謝、細胞增殖和死亡等過程［6-7］，維持細胞內鉀離子穩態具有重要的意義。

細胞內鉀離子穩態基本情況細胞內鉀離子穩態有兩個層面：一是細胞內液總鉀平衡，二是亞細胞結構鉀離子的分布平衡。囿于技術限制，關于細胞器中鉀離子的分布以及細胞內鉀離子濃度在不同生理和病理條件下的動態變化一直未有定論，但隨著近幾年關于靶向亞細胞結構的熒光探針、基因編碼鉀離子指示劑及光學技術的發展，研究者在幾個不同類別的細胞中均發現：胞核的鉀離子濃度最高（150～350 mmol/L）且細胞核基質的濃度高于核周間隙，細胞基質的鉀離子濃度居中（50～100 mmol/L），線粒體（40～50 mmol/L）、內質網（2～8 mmol/L）和溶酶體（2～50 mmol/L）的鉀離子濃度較低［8-10］，需要注意的是不同類型的細胞、不同病理狀態下細胞內鉀離子情況并不相同。

細胞內鉀離子濃度的測定長久以來，對細胞內鉀離子濃度的測定是研究細胞內鉀離子相關生理病理研究的瓶頸，直接測量難度較大、操作繁瑣，更多的研究是采用間接測量（電生理）的方法，通過對離子通道電流的分析間接推斷細胞內鉀離子的情況（表1）。

表1 細胞內鉀離子濃度測量方法Tab 1 Measuring methods of intracellular K+ concentration

原子吸收光譜法 將細胞裂解后對裂解液進行光譜分析，準確度高且可定量，但具有細胞破壞性。

核磁共振波譜法（39K-nuclear magnetic resonance，39K-NMR） 據核磁共振的原理測量鉀，操作時收集待測細胞至特殊小管，根據得到的譜圖進行分析［11］，此方法無細胞損傷性，但靈敏度和精確度低且難以獲得亞細胞結構的分布信息。

鉀離子選擇性玻璃電極法 玻璃電極由鉀離子選擇電極和參比電極共同組成，其中鉀離子選擇電極含特殊的含纈氨霉素的聚氯乙烯膜成分，當電極破壞細胞膜和細胞內液接觸后，可在聚氯乙烯膜上產生電位并與參比電極構成回路獲得電極電位，以此計算出細胞內鉀離子濃度。此方法準確、敏感度高［12］，但具有細胞損傷性且無法獲取鉀離子在細胞內的時空分布情況。

合成鉀離子敏感的熒光染料法 熒光探針可選擇性螯合細胞內游離鉀離子，當鉀離子與探針結合后可改變探針的構象，增加其量子產率，使光譜發生偏移，通過分析產生的熒光信號可獲得細胞內鉀離子濃度的數據。理想的鉀離子熒光探針應滿足對生理條件下細胞內鉀離子濃度變化的敏感性以及選擇特異性。PBFI是應用最早和最廣為人知的鉀離子熒光探針之一，但是它對鉀離子的選擇性差，易受到鈉離子干擾，而且操作繁瑣。后來研究者研制出鉀離子選擇性更高的探針，如KS2探針［13］和可降低假陽性率并用于活細胞成像的雙熒光探針［14-15］；還有能定位于亞細胞結構的鉀離子探針，如半定量檢測線粒體內鉀離子濃度變化的KS6探針［16］。

基因編碼的鉀離子指示劑 研究者發現生物體內存在可螯合鉀離子的鉀離子選擇性蛋白，為了改善化學合成熒光探針有一定細胞毒性、特異性差、低通量的缺點，他們提出可采用基因工程的方法，通過在原核生物體內共表達和提純具有高度鉀離子選擇性蛋白和熒光蛋白進而獲得基因編碼的鉀離子指示劑，并認為此方法更安全、高效［8］。此外，在鉀離子指示劑上添加細胞器特異序列可實現靶向亞細胞的鉀離子動態監測，推進對細胞器鉀離子功能的研究，目前有靶向線粒體的KS6［16］、Mt lc-LysM GEPII鉀離子探針［8］以及靶向細胞核的NUClc-LysMGEPII鉀離子探針［8］，這些探針具有高靈敏性、特異性、時空分布性、高通量的優勢。目前基于雙熒光能量共振轉移發光方式的指示劑有：GEPII系列［8］、KIRIN1-GR［17］；基于單熒光的有GINKO，和雙熒光發光方式相比，單熒光團體積小、適用于多熒光檢測［17］（表1）。

細胞內鉀離子穩態的調控機制由于鉀離子不能自由進出細胞膜結構，細胞內液鉀離子濃度穩態依賴于細胞膜上特殊通道的開放程度和細胞內外鉀離子電化學梯度；而亞細胞結構的鉀離子分布平衡則依賴于細胞器膜上的特殊通道（圖1）。

圖1 細胞內鉀離子穩態的基本情況及調控機制Fig 1 Intracellular K+ distribution and machinery for K+ regulation

細胞內總鉀平衡 鉀離子在細胞內外形成的電化學梯度和膜上的孔道性質共同決定鉀離子的進出方向，細胞膜上鉀離子流動的孔道主要有：鉀特異性通道、鉀離子交換體、鈉鉀泵、非選擇性陽離子通道和特殊“膜孔”結構。（1）鉀通道是鉀離子流動最常見的孔道，根據門控機制、結構和功能主要分成了5個家族：電壓門控鉀通道KV；內向整流鉀通道Kir；鈣和鈉激活大電導鉀通道SLO；小電導鈣激活鉀通道 SKCa以及雙孔鉀通道K2P［22］。由于胞內鉀離子濃度明顯高于胞外，大多鉀通道在一般生理條件下順電化學梯度介導鉀離子由胞內流向胞外。（2）鉀離子交換體和轉運體：如氫-鉀交換體（鉀離子進出方向取決于兩種離子在細胞內外的濃度差，酸中毒時氫離子轉運入胞內，鉀離子轉運出胞外）和鈉鉀二氯同向轉運體（介導鉀離子內流入胞）等；（3）鈉鉀泵：將鉀離子逆濃度梯度轉運至胞內，維持胞內高鉀環境；（4）非選擇性陽離子通道：如瞬時受體電位陽離子通道亞家族（transient receptor potential channel，TRPC），介導鉀離子由胞內流向胞外；（5）特殊膜孔：焦亡效應蛋白gasdermin D在胞膜上形成孔結構，結合鉀離子并介導鉀離子外流［23］。當鉀離子由胞內流向胞外時，細胞內鉀離子濃度減小；反之，細胞內鉀離子濃度增多。改變細胞外液鉀離子濃度，如增加細胞外鉀離子濃度可減弱電化學梯度，減小鉀離子外流，使胞內鉀濃度增多。

亞細胞結構間鉀離子分布的平衡 鉀離子在細胞內并非均勻分布，在鉀通道的調節下維持亞細胞結構間鉀離子分布平衡（表2），胞核鉀離子濃度最高，細胞基質次之，其他細胞器（線粒體、溶酶體、內質網等）濃度最低。目前亞細胞結構的膜上的鉀離子通道研究仍非常有限，一般認為鉀離子的流動方向是由胞漿流入線粒體、內質網、溶酶體和細胞核基質。細胞核維持高鉀離子水平的機制，細胞器膜上是否存在其他鉀離子孔道（如交換體等）待進一步研究。

鉀離子通道的調控機制由于鉀通道對鉀離子的高度特異性，鉀通道在細胞內鉀離子穩態調控占主體地位。目前已發現的鉀通道有80多種，每種鉀通道的調控機制各不相同。總體而言，主要包括通道本身的門控機制（電壓、機械張力、ATP、pH等）和信號分子對通道活性和表達水平的調控（如炎癥、氧化應激相關信號分子）。

門控機制 作為鉀離子通道本身的特性，鉀離子通道的開放可由膜電位/電壓（如電壓門控鉀通道Kv家族）、胞內外pH（如酸敏感的雙孔鉀通道TASK2）、機械刺激（如弱內向整流相關雙孔鉀通道TREK1）、ATP水平（如ATP敏感的鉀通道KATP）、胞內其他陽離子（Ca2+、Mg2+、Na+）濃度、G蛋白偶聯受體激活的G蛋白信號通路（如被激素激活）等調控。

信號通路 （1）炎癥相關信號通路：炎癥過程中產生的細胞因子可調控鉀通道活性，γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）通過與細胞膜上的受體結合，在近端腎小管細胞內產生過氧化物或過氧化亞硝基，使鉀離子通道發生氧化或亞硝基化進而被抑制；白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）可激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路，抑制鉀離子通道［24］。（2）氧代謝相關信號通路：多種鉀通道和氧化應激或氧代謝通路相關。缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是氧感受通路的關鍵轉錄因子，研究發現缺氧通過增加HIF-1上調鉀通道表達水平，如在肺動脈平滑肌細胞中上調BKCa表達［25］以及在B淋巴細胞中上調TASK2表達［26］。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是缺氧過程中線粒體代謝產物，線粒體ATP敏感的鉀通道常在缺氧的條件下被ROS產物活化［27］。ROS還可氧化修飾鉀通道進而改變通道活性，BK通道位于細胞內的3個蛋氨酸被ROS氧化修飾后活性增強而半胱氨酸被氧化修飾后活性減弱［28］。細胞內鈣離子濃度增加也常見于氧化應激過程，可激活鈣敏感鉀通道的開放。氧化應激過程還可通過激活cAMP/GMP依賴的蛋白激酶信號通路磷酸化鉀通道亞基，進而改變通道的活性。

細胞內鉀離子穩態的生理作用細胞內鉀離子基本功能是維持細胞靜息膜電位，這是可興奮細胞正常發揮其興奮功能的必要條件。此外，鉀離子還參與調控多種生命活動（圖2）。

調節酶及能量代謝 細胞內鉀離子通過穩定酶結構維持酶活性［29］，如丙酮酸激酶、丙酮酸脫氫酶、DNA雙鏈斷裂修復蛋白RAD51等；也可作為酶的輔因子，如鉀離子是己糖激酶Ⅱ的輔因子，促葡萄糖分解［6］。此外，細胞內鉀穩態參與細胞能量代謝過程：胞內鉀離子濃度降低時，AMP依賴的蛋白激酶通路活化，糖酵解過程被抑制，線粒體ATP生成減少，線粒體氧化磷酸化功能受抑制［6］。激活線粒體鉀通道，促線粒體內膜去極化，促呼吸鏈運行和ATP生成，脂肪酸氧化過程加強［30］。

調節遺傳物質的生物合成 細胞內鉀離子可與DNA結合，穩定核酸G-四鏈體結構，調節DNA復制［31］；胞內鉀離子參與調節轉錄因子的轉錄活性：抑制核膜上的鉀離子通道開放（如BKCa、KV1.3等），促核膜超極化，最終導致環磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）磷酸化，促進c-fos等極早期反應蛋白轉錄［10，32］。

調節細胞容積和形態 細胞內鉀離子維持細胞容積的穩態：鉀離子是胞內濃度最高的陽離子，是維持細胞內滲透壓的主要組成成分；而細胞內外的滲透壓差決定細胞液體流動方向，影響細胞的容積和形態。凋亡相關細胞容積減小與鉀離子通道激活介導的鉀離子外流相關［33］；當細胞過度腫脹時鉀離子通道也會被激活，進而降低細胞內鉀離子濃度，減小細胞內的滲透壓，抑制腫脹進一步加劇［34］。

調節細胞周期和增殖 增殖是細胞的基本功能，其中細胞周期的精準調控保障增殖的有序進行。最初研究者發現非興奮性細胞的細胞周期中伴隨著膜電位的周期性變化，G1期→S期超極化，G2期→M期去極化［35-36］；而鉀離子是維持靜息膜電位的主要離子，研究進一步發現細胞內鉀離子濃度的改變可直接影響細胞周期和增殖，抑制外周血淋巴細胞鉀離子通道活性或增加細胞外液鉀離子濃度進而提高細胞內鉀離子濃度，可抑制淋巴細胞增殖和分泌細胞因子［36］；我們團隊發現體外誘導纖維化的近端腎小管上皮細胞以及體內纖維化腎臟模型中細胞內鉀離子濃度減低，并促進上皮細胞G2/M期阻滯［5］。同時，鉀電流和鉀離子通道的表達水平可隨細胞周期變化［37］，鉀通道是調控細胞內鉀離子穩態的重要手段，鉀離子通道的開放通過影響細胞內鉀穩態進而調節細胞周期。

然而細胞內鉀離子調控細胞周期的具體機制尚缺乏統一的認識，目前有如下幾種學說：（1）鈣學說：細胞內鉀離子濃度的減低為鈣離子內流提供驅動力，促使細胞內鈣離子濃度的升高，鈣離子作為第二信使啟動Ca2+—鈣調蛋白/鈣調素依賴蛋白激酶（calmodulin/calmodulin kinase，CaM/CaMK）通路調控細胞周期關鍵蛋白，比如上調細胞周期抑制因子p27、p21等表達，阻滯細胞周期［37］；（2）信號通路學說：鉀離子通過調控cAMP依賴蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、P38絲裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen activated protein kinases，P38-MAPK）、細胞外調節蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）以及蛋白激酶B（Akt）相關信號通路改變細胞周期蛋白的表達水平［38］，但需更多的研究證實。

調節細胞死亡 胞內鉀穩態調控與凋亡的發生密切相關，凋亡的其中一個特征是細胞容積減小，而鉀離子作為胞內含量最高的離子對細胞容積的調控至關重要，胞膜鉀通道的激活、鉀離子外流和細胞內鉀離子濃度降低均可促進凋亡發生［33］。線粒體內膜上的鉀通道和線粒體鉀離子穩態也參與調控死亡，抑制線粒體鉀離子通道（TASK3、KV等）可促進ROS釋放、抑制呼吸鏈并誘導死亡［30］；還有研究提示激活線粒體鉀離子通道SK、增加線粒體鉀濃度可減輕細胞鐵死亡［39］。

調節細胞遷移和修復 細胞（尤其是表皮細胞）遷移是發生損傷修復的重要手段之一，遷移過程包括細胞骨架重構、細胞膜突出、前部的細胞外基質的局部黏附和后部的細胞外基質去黏附。研究者發現細胞遷移過程中細胞膜上的鉀離子通道分布不均勻，如腎上皮細胞發生遷移時，KV1.4通道聚集在板狀偽足的前部突出部分，抑制這部分的鉀離子通道會抑制細胞遷移，而KCa通道分布在胞體尾部，抑制這部分的離子通道同樣會抑制細胞遷移［40］；遷移相關信號通路如受體蛋白酪氨酸激酶（如表皮生長因子及受體）及非受體蛋白激酶（如ERK）信號通路的激活可上調鉀離子通道的表達、增加鉀離子外流進而促進細胞遷移。同時遷移信號通路也受鉀離子通道調控，抑制鉀離子通道可抑制遷移信號通路［41］。

目前鉀離子調控細胞遷移修復的機制包括：（1）鉀通道開放、鉀離子的外流為鈣離子內流提供驅動力，通過激活鈣信號通路促進細胞遷移［42］；（2）細胞內鉀離子直接可作為第二信使調控遷移相關蛋白合成［43］，也可調節局部滲透壓與容積，調控肌動蛋白促進細胞骨架重構［44］；（3）通過改變局部離子濃度影響細胞外基質組裝、交聯過程［42，45］。

調節免疫應答 細胞內鉀離子通過炎癥小體（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）活化、炎癥因子生成和免疫細胞功能調節參與機體的免疫應答。NLRP3介導的炎癥反應常伴隨著細胞內鉀離子外流、細胞內鉀離子濃度減低的現象［46］，細胞內鉀離子外流促進NLRP3進一步形成，激活細胞死亡的過程［23，47］。細胞內鉀離子外流可抑制DNA感受器環GMP-AMP合酶-干擾素刺激基因（cyclic GMP-AMP and the stimulator of interferon genes，cGAS-STING）反饋通路，調控I型干擾素的生成［23］。免疫細胞（T/B/NK細胞）上的鉀離子通道開放及其介導的細胞內鉀離子外流還可通過膜超極化為鈣離子的內流提供驅動力、增加細胞內鈣離子濃度，鈣離子作為第二信使可活化轉錄因子進而誘導下游基因轉錄促免疫細胞成熟、分化及發揮效應［48-49］，如鉀通道KV1.3和IKCa2的激活可促活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）的核定位并啟動下游基因轉錄，促T細胞增殖和分泌細胞因子［50］。

細胞內鉀離子穩態失衡和疾病的聯系

腫瘤 在多種腫瘤（如乳腺癌、宮頸癌、神經胚胎瘤、結腸癌、急性髓性白血病等）存在鉀通道表達異常［51-53］，研究進一步發現腫瘤的組織間液的鉀離子濃度升高［7］，二者均可影響細胞內鉀離子穩態，細胞內鉀失衡和腫瘤密切相關。細胞內鉀穩態失衡促腫瘤發生發展的機制復雜多樣，涉及細胞增殖死亡、損傷修復和免疫功能異常。細胞內鉀穩態失衡破壞細胞周期的有序進行，細胞周期蛋白（如cdc25、cdc2）表達異常［54］，促腫瘤細胞不斷分裂增殖；鉀離子通道（如KCa家族、KV通道家族）活化可促腫瘤細胞DNA損傷修復，增強腫瘤細胞對放化療的抵抗性［55］，高表達鉀離子通道的腫瘤組織可能提示不良預后；細胞內鉀離子還參與調節腫瘤免疫，腫瘤微環境的鉀離子濃度高于正常組織的細胞外液，造成其中的T細胞內鉀離子濃度升高，增強磷酸酶PP2A的活性并抑制蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白（Akt-mTOR）通路磷酸化程度，最終抑制T細胞發揮效應，削弱對腫瘤細胞的殺傷作用［7］。

急性缺血相關疾病 細胞膜鉀通道（KV、KATP、TREK1等）開放可通過抑制鈣超載、促DNA損傷修復和減輕凋亡在多種急性缺血性臟器損傷中發揮保護作用，包括急性心肌梗死［56］、卒中［57］、急性缺血再灌注腎小管損傷［58］等。線粒體內膜鉀通道（如BK）的開放可減輕缺血誘導的心肌損傷——阻斷或抑制線粒體BK通道可抑制線粒體呼吸鏈，增加ROS產生，增加細胞凋亡，最終加劇心肌損傷［59-60］。

自身免疫疾病 鉀通道的異常表達（增多或減低）、異常功能及其介導的細胞內鉀離子穩態失衡和自身免疫疾病的發生發展密切相關，包括系統性紅斑狼瘡［61］、多發性硬化［62］、炎癥性腸病［62-63］、類風濕性關節炎［64］等，其中的病理生理機制尚未明確。自身免疫疾病模型中的免疫細胞（B/T/NK細胞）常見鉀離子通道表達上調、功能過度活化以及細胞內鉀離子濃度減低，細胞內鉀離子濃度異常減低可促進免疫細胞的異常活化，而免疫細胞的過度激活是自身免疫疾病的重要發病機制之一［65］；而在病變臟器常見鉀離子通道表達減少、通道活性受抑制，最終抑制組織器官發揮功能［66］。

內分泌疾病 內分泌器官的鉀離子通道和細胞內鉀離子穩態維持內分泌激素的正常分泌，鉀離子通道表達減少、功能缺失可見于糖尿病（新生兒糖尿病［67］、2型糖尿病［68］）以及高醛固酮血癥［69］，并造成激素分泌紊亂。腎上腺鉀通道（如TASK1、TASK3）的缺失造成細胞內鉀離子濃度升高、細胞持續去極化，細胞興奮周期被破壞、鈣離子內流增強，不斷合成和分泌醛固酮激素［70］。

神經退行性疾病 近年研究者發現鉀通道表達減少和功能受損常見于神經退行性疾病，包括亨廷頓病［71］、帕金森病［72］、阿爾茲海默病［73］等，并可作為疾病治療的重要靶點之一。胞膜上的鉀通道表達減少、細胞內鉀離子濃度升高可直接導致神經系統的興奮毒性、細胞受損和神經環路的破壞［74］；激活線粒體鉀通道如KATP可減輕線粒體損傷、保護膽堿能中間神經元，最終緩解亨廷頓病［75］；TMEM175是鉀離子進出溶酶體的主要通道并維持溶酶體功能［76］，TMEM175表達減少與功能缺失可通過抑制溶酶體功能，加劇α-突觸核蛋白的異常沉積、多巴胺神經元的減少和運動功能損害，最終促進帕金森病的進展［77］。

結語鉀離子主要分布于細胞內液，細胞內鉀離子穩態的改變往往先于細胞外液。細胞內鉀穩態由細胞內、外液和細胞器間鉀離子分布平衡共同維持，參與細胞生長死亡、黏附遷移、能量代謝和免疫調控等多種活動。細胞內鉀離子穩態失衡與腫瘤、急性缺血、自身免疫、內分泌、神經退行性等疾病的發生發展密切相關，并提示疾病進展、預后，靶向干預鉀離子通道以及糾正細胞內電解質水平為臨床提供了新的治療思路。受測量細胞內鉀離子濃度檢測技術的限制，先前大多數研究都是通過鉀通道的功能變化間接推測細胞內鉀離子濃度的改變，缺乏細胞內鉀穩態失衡與疾病發生發展相關性的直接證據，總體上對胞內鉀離子的調控機制及在細胞功能調控中的作用機制的認知是遠遠不夠的。近年鉀離子敏感的熒光探針和基因編碼的鉀離子指示劑技術手段的發展將進一步促進人們對細胞內鉀離子穩態調控機制的探索，并為疾病的診療提供新的方向。

作者貢獻聲明顏芷昕 文獻檢索，綜述撰寫，繪圖，制表。宋娜娜 綜述修訂和審校。丁小強 綜述構思和審校。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。