梨果實發育過程中酚類物質組成及抗氧化活性比較

盧登洋， 王鑫， 唐章虎， 吳翠云*， 蒲云峰，閆敏， 鮑荊凱， 姜喜*

（1.塔里木大學園藝與林學學院，南疆特色果樹高效優質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300； 2.新疆農業科學院輪臺果樹資源圃，新疆 巴音郭楞 841600； 3.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

梨是薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pomaceae）梨屬（PyrusL.）落葉果樹[1-2]，中國是梨的起源中心和主要的多樣性中心之一，梨樹在中國已有3 000多年的栽培歷史[3-5]。梨味甜、汁液多、肉質脆，具有較多的營養物質和一定的保健功能[6-7]。近年來，隨著人們對高品質生活的追求，越來越多的消費者喜歡具有一定營養保健功能的優良梨品種。大量研究表明，梨果實中的酚類物質是重要的抗氧化成分[8-10]，抗氧化活性是近年來研究的熱點，也是反映水果品質的重要指標之一。

在梨果實發育過程中，果實中的總黃酮和總酚含量大部分都呈現下降趨勢。研究發現，梨果實中的總酚含量、總黃酮含量和1,1-二苯基-2-苦肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical，DPPH）自由基清除能力隨著果實發育呈逐漸降低的趨勢[11-13]，且晚熟梨的總酚含量比早熟梨高30%～40%[14]。目前關于梨果實的多酚類物質的研究多以采后梨果實為試驗材料，關于不同品種梨果實田間栽培過程中多酚類物質組成、含量和抗氧化活性變化規律的研究報道較少。本試驗對白梨系統的碭山酥梨、西洋梨系統的庫車阿木特、麻梨果實發育過程中多酚類物質組成、含量及抗氧化活性進行研究，調查不同梨品種多酚等功能性成分的動態變化，為3 種梨果實品質的形成規律和功能性新品種選育提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為碭山酥梨、庫車阿木特和麻梨，均采自新疆農業科學院輪臺果樹資源圃。隨機抽取常規管理、樹勢健壯、樹冠大小基本一致且無病害的3株樹，分別于盛花期后50 d（5月25日）開始，每隔15 d隨機采集樹冠外圍中部、東、南、西、北5個方向、大小均勻一致且無病蟲害的果實共30個，直至果實完全成熟（9月20日）。每次采集樣品后置于冰盒中保存并迅速運回實驗室備用。試驗用蘆丁和沒食子酸購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 將果實清洗干凈、控干水分后，在每個果實中部位置橫切約3 mm帶皮果實切片，放到-20 ℃冰箱預凍后用真空凍干機凍干，然后用研磨儀打成粉末，放到-80 ℃超低溫冰箱備用。精確稱取1.000 g 凍干果肉，加入25 mL 乙醇超聲30 min，并于5 000 r·min-1離心20 min，取上清液，重復3次。樣液用于總黃酮、總酚、DPPH、2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2, 2’-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS+）含量測定和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。

1.2.2 總黃酮、總酚含量測定 總黃酮含量的測定采用硝酸鋁比色法[15]，用蘆丁作為標準品制作標準曲線，回歸方程為y=0.225 7x+0.024 1（R2=0.991 8），將標準曲線中算出的結果換算為以每克梨果干重（dry weight, DW)中含蘆丁當量（rutin equivalent,RE）毫克數表示（mg RE·g-1DW）。總酚含量的測定采用Folin-酚法[15]，用沒食子酸作為標準品制作標準曲線，回歸方程為y=1.866 7x+0.031 2（R2=0.998 5），將標準曲線中算出的結果換算為以每克梨果干重中所含沒食子酸當量（gallic acid equivalent, CAE）毫克數表示（mg GAE·g-1DW）。

1.2.3 高效液相色譜分析 用外標法測定梨果實中的酚類物質組成與含量，具體色譜條件參照Pu等[16]的方法。

1.2.4 抗氧化活性測定 用DPPH、ABTS+自由基清除法[15]測定，以Trolox 作對照，DPPH、ABTS+自由基清除能力的標準曲線回歸方程分別為y=4.940 1x-0.039 9（R2=0.996 0）、y=6.272 0x-0.028 4（R2=0.996 9），測定結果以每克梨果干重中所含維生素E 當量（vitamin E equivalent, TE）毫克數計（μmol TE·g-1DW）。

1.3 數據處理

用Excel 2019 分析測量數據，結合SPSS 17.0進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 梨果實發育過程中總黃酮、總酚含量的動態變化分析

2.1.1 梨果實發育過程中總黃酮含量的動態變化 由圖1可以看出，3種梨果實在發育過程中總黃酮含量變化趨勢基本一致，在盛花后50 d 時含量較高，隨著果實的發育逐漸降低。果實發育前期，庫車阿木特、碭山酥梨和麻梨的總黃酮含量降低迅速，由盛花后50 d 時的19.94、28.91 和23.41 mg RE·g-1DW 分別下降至80 d 時的10.20、10.12和9.82 mg RE·g-1DW，3個梨品種的降幅分別為48.83%、64.99%和58.04%；至果實成熟時，總黃酮含量分別降至4.35、0.60 和0.62 mg RE·g-1DW。3個梨品種果實中，幼果期總黃酮含量以碭山酥梨較高，庫車阿木特果實中含量較低；而果實成熟時，庫車阿木特果實中總黃酮含量明顯高于麻梨和碭山酥梨，說明在果實發育過程中庫車阿木特的總黃酮含量變幅較小，碭山酥梨的總黃酮含量變幅較大。

圖1 梨果實發育過程中總黃酮含量的動態變化Fig. 1 Dynamic changes of total flavonoids content during pear fruit development

2.1.2 梨果實發育過程中總酚含量的動態變化由圖2 可知，3 種梨果實的總酚含量在發育過程中變化基本一致。盛花后50 d時碭山酥梨和麻梨果實中總酚含量明顯高于庫車阿木特，分別達16.28和16.45 mg GAE·g-1DW，而庫車阿木特果實中總酚含量為10.51 mg GAE·g-1DW；隨著果實的生長，碭山酥梨、麻梨和庫車阿木特果實中總酚含量80 d時分別下降至6.89、5.78 和6.44 mg GAE·g-1DW，3 個梨品種的降幅分別為57.65%、64.86% 和38.71%。在盛花后125 d 時庫車阿木特果實中總酚含量降至最低，為2.95 mg GAE·g-1DW，此后維持在3.5 mg GAE·g-1DW 左右；碭山酥梨和麻梨中總酚含量在成熟時降至最低，分別為2.21 和1.51 mg GAE·g-1DW。在果實發育過程中，3 種梨果實的總酚含量均出現不同程度的波動，其中麻梨的總酚含量變動幅度較大，庫車阿木特變幅較小。

圖2 梨果實發育過程中總酚含量的動態變化Fig. 2 Dynamic changes of total phenol content during pear fruit development

2.2 梨果實發育過程中酚類物質組分含量的變化分析

HPLC 結果（圖3）表明，3 種梨果實發育過程中共檢測到13 種酚類物質。梨果實中的酚類物質含量均在幼果期較高，在成熟期含量較低；其中，熊果苷、槲皮葡萄糖苷、異鼠李素3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素酰化己糖苷等酚類物質含量隨著果實的發育逐漸降低；兒茶素、山奈酚-雙脫氧己糖苷、表兒茶素、槲皮素鼠李糖苷、蘆丁、異鼠李素3-O-蕓香苷、山奈酚3-O-蕓香苷等酚類物質含量隨著果實發育呈現出不斷上下起伏的變化趨勢，但其含量仍在幼果期較高。

圖3 梨果實在發育過程中酚類物質組分含量變化Fig. 3 Changes of phenolic components during pear fruit development

在13 種酚類物質中，以熊果苷含量最高，平均達到3 353.43 μg·g-1DW，占總組分的51.88%；其次是綠原酸，平均含量為2 350.29 μg·g-1DW，占總組分的36.34%；其他酚類組分含量較低，在8.09～150.65 μg·g-1DW 之間，僅占總酚含量的0.13%～2.33%，其中含量最少的是異鼠李素酰化己糖苷。在幼果期，庫車阿木特、碭山酥梨、麻梨的熊果苷和綠原酸含量分別是成熟期的5.36 和1.73倍、30.97和6.00倍、26.20和28.32倍。碭山酥梨果實中熊果苷、山奈酚-雙脫氧己糖苷、綠原酸、山奈-3-氧-蕓香苷、兒茶素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素酰化己糖苷含量均比庫車阿木特和麻梨高。3種梨果實兒茶素、山奈酚-3-氧-蕓香苷、表兒茶素、異鼠李素3-O-蕓香苷和蘆丁在果實發育期波動較大，不同品種之間存在差異。從HPLC結果可以看出，在梨果實發育過程中，碭山酥梨的熊果苷和綠原酸含量較庫車阿木特和麻梨分別高49.40%和30.61%、57.34%和19.35%。

2.3 梨果實發育過程中抗氧化活性的動態變化分析

2.3.1 梨果實DPPH 自由基清除能力 從圖4 可以看出，3種梨果實發育過程中的DPPH 自由基清除能力大致呈現出由高到低的變化趨勢。在果實發育前期，庫車阿木特、碭山酥梨和麻梨的DPPH自由基清除能力降低迅速，由盛花后50 d 時的63.89、68.06 和61.11 μmol TE·g-1DW 分別下降至80 d 時的28.18、25.93 和31.37 μmol TE·g-1DW，3 種梨的降幅分別為55.90%、61.90%和48.68%；庫車阿木特和碭山酥梨的DPPH 自由基清除能力均在盛花后140 d 時達到最低，分別為17.00 和14.39 μmol TE·g-1DW，而麻梨在果實成熟期最低，為12.18 μmol TE·g-1DW。

圖4 梨果實DPPH自由基清除能力變化Fig. 4 Changes in DPPH free radical scavenging capacity in pear fruit

2.3.2 梨果實ABTS+自由基清除能力 從圖5 可知，3 種梨的ABTS+自由基清除能力在果實發育過程中呈現不斷變化的趨勢。在盛花后50 d時，碭山酥梨和麻梨果實中ABTS+自由基清除能力明顯高于庫車阿木特，分別達到164.60 和167.76 μmol TE·g-1DW，而庫車阿木特果實中ABTS+自由基清除能力為102.64 μmol TE·g-1DW；隨著果實的生長，盛花后65 d 時，麻梨、碭山酥梨和庫車阿木特ABTS+自由基清除能力分別下降至88.88、62.21 和38.91 μmol TE·g-1DW，3 種梨的降幅分別為46.00%、60.53%和62.09%。在幼果期時，碭山酥梨和麻梨果實中ABTS+自由基清除能力較高，庫車阿木特較低；而在果實成熟時，以碭山酥梨的ABTS+自由基清除能力最高，明顯高于庫車阿木特和麻梨。

2.4 梨果實發育過程中酚類物質與抗氧化活性的相關性分析

由表1可知，梨果實的抗氧化活性（即DPPH、ABTS+自由基清除能力）與總黃酮、總酚以及13種酚類物質的含量均存在正相關關系，3 種梨果實中總黃酮、總酚、熊果苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、綠原酸、兒茶素、異鼠李素酰化己糖苷和表兒茶素等物質與DPPH 自由基清除能力均存在極顯著正相關關系（P＜0.01），且相關系數達0.95 及以上。梨果實中總酚、熊果苷、綠原酸、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-雙脫氧己糖苷、槲皮素鼠李糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷等酚類物質與ABTS+自由基清除能力均存在極顯著正相關關系（P＜0.01），且相關系數達0.90 及以上。蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香苷與DPPH 自由基清除能力呈顯著正相關（P＜0.05），相比之下相關性稍弱些，但對梨果實的抗氧化活性也可產生重要影響。

表1 不同品種梨果實發育過程中酚類物質與抗氧化活性的相關性分析Table 1 Correlation analysis between phenolic substances and antioxidant activity during fruit development of different pear varieties

3 討論

多酚是梨果實中重要的功能成分，富含多酚的梨果實具有保健功能和較高的營養價值[12]。本研究所測試的庫車阿木特、碭山酥梨、麻梨果實中總酚、總黃酮、酚類物質和抗氧化活性均存在差別。3 種梨果實的總黃酮和總酚含量在發育過程中變化基本一致，呈現出前期高、后期低的變化趨勢，庫車阿木特、碭山酥梨和麻梨在果實成熟期與幼果期相比，其總黃酮和總酚含量分別下降了87.20%、63.84%、97.93% 和 86.44%、97.33%、90.82%，與劉杰超等[17]發現棗果實在成熟期時總酚含量比幼果期低60%的研究結果相似。不同梨品種在不同發育期多酚物質含量變化趨勢基本一致，但變化幅度差別較大[18]。因此，可以進一步研究品種間多酚積累規律，為培育具有特殊營養功能的優良梨品種奠定基礎。

本研究顯示，熊果苷、綠原酸是梨果實中最主要的酚類物質，而蘋果中主要的多酚物質為綠原酸、表兒茶素、兒茶素和蘆丁等[19]。在幼果期，庫車阿木特、碭山梨和麻梨的熊果苷和綠原酸含量分別是成熟期的5.36 和1.73 倍、30.97 和6.00 倍、26.20和28.32倍，表明果實發育階段越早，酚類物質越豐富，因此在梨樹栽培管理中的疏果階段，可以利用疏除的幼果提取其功能性成分，比如熊果苷的提取物可應用于美白化妝品，綠原酸的提取物可用于抗菌、抗病毒的保健品和藥物，從而提高梨果的應用價值[20]。在3種梨果實發育過程中，熊果苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、綠原酸、異鼠李素3-O-葡萄糖苷、槲皮葡萄糖苷、異鼠李素酰化己糖苷等酚類物質含量呈下降趨勢；麻梨的異鼠李素酰化己糖苷和異鼠李素3-O-葡萄糖苷在盛花后125 和140 d 均未測出。因此，不同品種間酚類物質的變化規律和范圍略有不同[21-22]。

目前用于研究植物中抗氧化活性的方法有很多，但近年來最常用的方法是通過清除自由基的方法，這些方法有快速、簡單、穩定的優點[23]。本文通過清除DPPH 和ABTS+的抗氧化能力來評價3 種梨果實發育過程中的抗氧化活性。抗氧化活性檢測發現，在果實發育前期，庫車阿木特、碭山酥梨和麻梨的DPPH 和ABTS+自由基清除能力逐漸降低，盡管在果實發育過程中，3 種梨果實的DPPH、ABTS+自由基清除能力呈現不完全一致的變化趨勢，但總體碭山酥梨的抗氧化能力要強于其他2個品種。

相關性分析顯示，3 種梨果實抗氧化活性與總黃酮、總酚以及13 種酚類物質含量均存在正相關關系，其中梨果實中總黃酮、總酚、熊果苷、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素酰化己糖苷等物質與DPPH 自由基清除能力均存在極顯著正相關關系（P＜0.01），且相關系數達到0.95及以上。梨果實中最主要的抗氧化活性成分是總酚、熊果苷、綠原酸等，與張云[24]和黃春輝等[25]在獼猴桃的研究中發現獼猴桃的抗氧化能力與總酚含量呈顯著正相關的研究結果一致。