皰疹病毒引起內質網應激/未折疊蛋白反應研究進展

蔡海情， 王微， 曾茂芹， 畢文文， 陳莉， 張黔東， 袁陽， 文明，2*

（1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025； 2.貴州省動物生物制品工程技術研究中心，貴陽 550025）

皰疹病毒（Herpesvirus）是一類有囊膜的雙鏈DNA 病毒，其基因組大小約125～241 kbp，包含70～170 個基因，結構復雜，由對稱的正二十面體結構和非對稱成分組成。一般來說，皰疹病毒與宿主共同進化并高度適應宿主，宿主包括許多哺乳動物、鳥類、爬行動物和人等[1]。初次感染后他們能夠建立終身潛伏感染，在此期間病毒反復感染，給人和動物帶來了重大損害。其中，人類Ⅰ型單純皰疹病毒（herpes simplex virus-Ⅰ， HSV-Ⅰ）可引起人體蔓延性皮炎，在宿主細胞中呈潛伏感染且終生帶毒，嚴重危害人類健康[2]；馬立克病病毒（marek’s disease virus，MDV）、傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，IBDV）、鴨腸炎病毒（duck enteritis virus，DEV）和偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）等引起畜禽的多種器官損傷和免疫性疾病，嚴重威脅畜禽養殖業健康發展，造成了嚴重的經濟損失。

通常情況下，皰疹病毒復制涉及病毒粒子被膜蛋白與細胞表面受體相互作用，然后通過細胞表面的膜融合或內吞作用進入，脫殼并被運送到核孔中，基因組進入細胞核[3]。病毒早期基因編碼DNA 復制并合成多種蛋白質，參與調節宿主細胞新陳代謝或免疫反應，晚期基因主要編碼病毒粒子蛋白。由于皰疹病毒復制給宿主內質網（endoplasmic reticulum，ER）帶來了過重的負擔，以產生病毒蛋白并促進病毒顆粒運輸，從而引起內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。為了應對ERS 和維持ER 蛋白平衡，細胞啟動未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）[4]。如單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）必需借用宿主細胞的蛋白合成系統合成自身蛋白，用于組裝子代病毒粒子；細胞出于自我保護會啟動ERS 介導的蛋白降解、炎癥反應、自噬、凋亡等抑制HSV 病毒蛋白的合成、降解病毒蛋白或誘導伴侶分子表達，從而誘導UPR[5]；MDV 在復制時誘發嚴重的免疫抑制，導致促炎細胞因子過度表達，激活UPR 可能單獨或與其他先天傳感途徑協同作用，導致核轉錄因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）被激活，介導免疫病理學和神經損傷[6]。同HSV 和MDV 一樣，DEV 和PRV 也會引發ERS，激活UPR，導致炎癥反應的加劇和其他級聯反應[7-8]。

內質網是合成分泌蛋白和膜蛋白、蛋白翻譯后修飾、調控鈣離子儲存和脂類合成的細胞器，具有重要生理功能[9]。一般情況下，新生蛋白在分子伴侶和折疊酶（統稱為內質網伴侶）的作用下折疊，正確折疊的蛋白質被運輸到高爾基體進一步加工，形成分泌蛋白，進入內膜系統或被分泌到細胞外發揮作用。但是，當細胞生長條件發生變化（如DNA 損傷、化學誘導、微生物感染等）時，內質網蛋白質發生未折疊或錯誤折疊，未折疊或錯誤折疊的蛋白質就會被保留在內質網中，通過內質網相關降解機制（endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD）反轉運到細胞質中，由蛋白酶體降解。一般情況下上述蛋白會被激活的ER 分子伴侶和ERAD 處理，當細胞合成的分泌蛋白質超過折疊裝置和ERAD 的能力時，未折疊的蛋白質就會大量堆積在內質網中，并傾向于形成蛋白質聚集體，進而導致細胞蛋白質合成功能的異常甚至引起細胞凋亡。為了緩解這種應激狀態，真核細胞激活了一系列的自我防御機制，統稱為未折疊蛋白反應（UPR），從而恢復內質網穩態[10-14]（圖1）。近年來，國內外研究人員對皰疹病毒的研究逐漸增多，主要集中在HSV[15]、PRV[16]、MDV[17]和DEV[18]等，本文概述了上述皰疹病毒對ERS 及UPR 之間的相互作用，以期為研究其相關分子機制提供參考。

圖1 內質網應激反應Fig. 1 Endoplasmic reticulum stress response

1 內質網應激/未折疊蛋白對病毒的反應機制

在病毒感染后，細胞激活未折疊蛋白反應通路，使它們免受內質網應激（ERS）所誘導的凋亡反應[19]。病毒復制時，其劫持宿主翻譯裝置，產生大量蛋白，內質網的動態平衡遭到破壞，導致錯誤折疊和未折疊蛋白的快速積累，激活ERS，進而啟動未折疊蛋白反應（UPR）[20]。一些病毒甚至利用內質網作為復制位點，以達到在細胞內快速增殖的目的，如丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）[21]和非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）[22]。此外，大量研究發現乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）[23]、黃病毒（flavivirus）[24]、博爾納病毒（borna virus）[25]等均可引起ERS，機體為減輕ERS 利用UPR 來恢復內質網的相對穩定。哺乳動物細胞中，病毒引起的ERS主要由以下ER跨膜受體介導：RNA 樣蛋白激酶樣內質網激酶（protein kinase RNA-like ER kinase，PERK）、肌醇需求激酶1（inositol-requiring kinase 1，IRE1）及激活轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）。在正常細胞中3 個感受器與內質網駐留伴侶免疫結合球蛋白（binding immunoglobulin protein，BIP）或葡萄糖調節蛋白78（glucoseregulated protein 78，GRP78）結合而維持抑制狀態，當細胞發生ERS 時，BIP 優先與錯誤折疊蛋白質結合，PERK 和ATF6 解離以減輕應激[26-27]。PERK 使真核細胞起始因子2 的α 亞基（α-subunit of eukaryotic initiation factor 2，eIF2α）磷酸化，終止鳥嘌呤三核苷酸磷酸（guanosine triphosphate,GTP）與鳥嘌呤二核苷酸磷酸（guanosine diphosphate，GDP）的交換作用，從而減緩或暫停蛋白質合成，緩解內質網的超負荷。ATF6則上調ER 蛋白和ERAD 表達，擴大內質網折疊能力來緩解ERS。IRE1 被未折疊蛋白的直接結合激活，并剪接XBP1（X box-binding protein 1），XBP1 是活躍的轉錄因子，通過上調多種折疊酶及與蛋白質折疊相關的UPR目標基因，參與蛋白質轉運、脂質合成等過程以校正內質網穩態[28]。活化的IRE1、ATF6 和PERK 可分別通過各自的信號通路啟動UPR。

1.1 PERK-eIF2α通路

PERK 屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與IRE1同為Ⅰ型跨膜蛋白并且結構相似，ER腔中感測到錯誤折疊或未折疊蛋白質時，PERK 與BIP/GRP78發生解離，形成二聚體，引發反式自磷酸化，激活下游信號通路[29]。PERK 經寡聚和自動磷酸化形成活性PERK 使真核細胞翻譯起始因子2 的α 亞基（eIF2α）磷酸化，減少內質網蛋白質合成，緩解ERS[30-31]。然而，這種數量有限的活性eIF2α 會選擇性地增加激活轉錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）的翻譯。ATF4 是一種促進細胞生存的轉錄因子，激活后可參與細胞凋亡、生物合成和胞內氧化還原反應等過程[32]。ATF4 誘導生長阻滯和DNA 損傷誘導蛋白34（growth arrest and DNA damage-inducible protein34，GADD34），它是蛋白磷酸酶1（PP1）的調節亞基，可引起生長停滯和誘導DNA 損傷，其招募PP1 磷酸化eIF2α，使PERK-eIF2α 下調，減輕翻譯衰減，最后在UPR中構成1 個負反饋環[33]，維持蛋白質合成過程中的“起始-終止”這一動態平衡。但在過度、持久的內質網應激條件下，活化的PERK 無法維持這一動態平衡，細胞無法恢復到正常的生理狀態，就會啟動調控細胞凋亡的未折疊蛋白反應信號通路PERK-ATF4-CHOP。凋亡相關蛋白CHOP（pro-apoptotic CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein）是一種29 kD 的蛋白質，具有169 個（人類）或168 個（嚙齒動物）氨基酸殘基[34]，屬于CCAAT/增強子結合蛋白家族，參與編碼、增殖、分化、表達以及能量代謝等基因的調節。研究證明CHOP 包含2 個功能結構域，1 個N 端轉錄激活結構域和1 個C 端堿性亮氨酸拉鏈（basicleucine zipper，bZIP）結構域，bZIP 在誘導細胞凋亡中起著至關重要的作用[35-36]。CHOP 介導的GADD34 激活促進elF2α 蛋白去磷酸化，逆轉翻譯抑制。內質網釋放翻譯有助于未折疊蛋白的積累，同時允許編碼促凋亡蛋白的mRNAs 翻譯[37]。因此，CHOP被認為是ERS誘導凋亡蛋白最重要的介導物之一，參與多種基因的調控及表達[38]，如CHOP、生長阻滯和DNA 損傷誘導蛋白153（growth arrest and DNA damage-inducible protein153，GADD153）在UPR 中發揮協同作用，激活凋亡相關靶點GADD34、死亡受體5（death receptor-5，DR5）、內質網氧化還原酶-1（endoplasmic reticulum oxidoreductase 1，ERO1）等促進細胞凋亡[37]。

1.2 IRE1-XBP1通路

IRE1是含有絲氨酸-蘇氨酸激酶結構域和內切核酸酶結構域的雙活性酶[39]。IRE1 在哺乳動物中存在2 種異構體—IRE1α 和IRE1β，IRE1α 主要存在于哺乳動物細胞中，IRE1β 一般在消化道上皮細胞中表達[40]。當IRE1從GRP78解離時，通過同源二聚化和反式自磷酸化機制促進IRE1α的活化，進而激活蘇氨酸激酶和核酸內切酶活性。活化的IRE1 從XBP1 中移除26 個核苷酸組成的內含子，形成剪接的XBP1（S），隨后被翻譯成bZIP 轉錄因子，進而激活增強ER 蛋白折疊能力、磷脂生物合成和ERAD 基因的轉錄[41-42]。XBP1（S）還能激活Hsp40 家族成員P58IPK，P58IPK 可以結合PERK 并抑制其對磷酸化eIF2a 的活性。IRE1 本身可以通過調節其依賴衰變（regulated IRE1-dependent mRNA decay，RIDD）途徑降解ER結合的mRNAs，從而限制蛋白質翻譯并降低ER管腔內部蛋白質折疊負荷[43]。但在內質網持續應激時，胞質中游離的IRE1 與腫瘤壞死因子α 受體相關因子2（tumor necrosis factor receptor associated factor 2，TRAF2）結合并使其活化，TRAF2 能進一步激活NF-κB 和C-jun N 末端激酶（c-jun-Nterminal kinase，JNK）通路，從而激活細胞內的炎癥反應誘導細胞凋亡[44]。在ERS 的早期階段，JNK 介導的B 細胞瘤蛋白2（B-cell lymphoma protein-2，BCL-2）磷酸化導致Beclin1 的解離和自噬激活[45]。此外，IRE1-XBP1 信號通路在病毒感染中起著重要作用。首先，病毒感染后ERAD 的激活加速了蛋白質的降解[46]；其次，CHOP 誘導凋亡，并在誘導自噬中發揮作用；第三，IRE1 介導內質網中部分mRNA 選擇性降解，減少宿主相關蛋白產生，促進自身復制，但每種病毒由IRE1-XBP1介導的細胞反應不同[47]。

1.3 ATF6途徑

ATF6 是一種bZIP 轉錄因子，但最初是作為Ⅱ型跨膜蛋白合成的，其含有內質網應激敏感的管腔結構域、跨膜結構域和胞質N-末端結構域[27]。ATF6作為ERS的下游啟動因子，由內質網衍生的囊泡包裝，并移位到高爾基復合體，在高爾基復合體中被絲氨酸蛋白酶位點1（serine protease site-1，S1P）切割管腔結構域，N-端部分隨后被金屬蛋白酶位點2（metalloprotease site-2 protease，S2P）切割，釋放含活性的N 端DNA 結合域ATF6（N）[48]。ATF6（N）移位到細胞核并激活提高ER 折疊能力的基因，如ERS 反應元件（endoplasmic reticulum stress element，ERSE）基因、BIP、GRP94、蛋白二硫化物異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）、CHOP 等，同時激活XBP1 和ERAD 等基因的轉錄[49]。

總體而言，這3 個分支通過減少內質網多肽鏈的合成、降解內質網定位的蛋白和擴大內質網折疊能力來修復內質網應激（圖2）。

圖2 未折疊蛋白反應通路Fig. 2 Unfolded protein reaction pathway

2 皰疹病毒與內質網應激

根據國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的定義，皰疹病毒包含ɑ、β、γ 3 個亞科，還有其他新發現未分類的，如鸚鵡酸ɑ 皰疹病毒5、獼猴γ 皰疹病毒1等[1]。皰疹病毒在自然宿主范圍內受到限制，并高度適應宿主，嚴重感染通常只在胎兒、免疫功能低下的人或某些宿主中體現。皰疹病毒作為胞內寄生生物，在細胞內的復制有一套自己的控制系統，在其感染期間，病毒能夠劫持宿主的翻譯機器，大量合成自身相關蛋白，使內質網充滿病毒蛋白，導致內質網直接或間接發生應激，引起未折疊蛋白反應[50]。病毒蛋白在內質網中的積聚對蛋白質折疊提出了更高的要求，可能導致內質網穩態失衡甚至影響宿主細胞的存活。皰疹病毒不僅利用宿主細胞器來生產病毒糖蛋白，甚至利用內質網作為復制位點來組裝子代病毒。以下集中概述HSV-Ⅰ、PRV、MDV 和DEV 等皰疹病毒對ERS 及UPR之間的的相互作用，

2.1 Ⅰ型單純皰疹病毒

Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV-Ⅰ）屬于α皰疹病毒亞科，感染細胞后引起ERS，通過調控UPR 和ERAD 機制促進病毒復制，抑制細胞凋亡。Burnett 等[51]研究發現，HSV-Ⅰ在感染早期可有效解除UPR，只激活ATF6 信號通路，而PERK 和IRE1/XBP1 通路被抑制；在HSV-Ⅰ感染后期，eIF2α/ATF4 信號臂活性增加，提示病毒粒子組裝和輸出完成，釋放UPR 信號轉導的抑制；同時發現，插入病毒序列的ICP0 真核載體啟動子對ERS有明顯的響應，提示HSV-Ⅰ可能利用ICP0作為傳感器來調節細胞的應激反應。Zhang 等[52]研究HSV-1 UL41 蛋白在抑制IRE1/XBP1 時發現，UL41 的異位表達使XBP1 翻譯降低，并阻斷ERS誘導劑毒胡蘿卜素（thapsigargin，Tg）誘導的XBP1剪接激活；野生型HSV-1（wild type HSV-1，WT-HSV-1）可降低Tg 誘導的XBP1mRNA 轉錄，而UL41缺失突變體R2621 則不能；然而，未經藥物預處理的WT HSV-Ⅰ和R2621 均可降低XBP1（S）的mRNA 轉錄和蛋白翻譯，推測在R2621感染過程中可能存在其他機制對XBP1（S）有抑制作用；同時發現HSV-Ⅰ可以通過抑制IRE1/XBP1 來避免可能對病毒復制不利的細胞反應，這可能與XBP1（S）靶基因編碼的ERAD 蛋白降解病毒蛋白有關。此前XBP1（S）也被報道能增強樹突狀細胞中β 干擾素的產生，從而抑制該病毒的復制[53]。因此HSV-Ⅰ感染細胞后發生UPR 的分子機制還需要進一步深入研究。

2.2 偽狂犬病病毒

偽狂犬病病毒（PRV）屬于α 皰疹病毒亞科，通過破壞內質網的動態平衡，誘導ERS 并觸發未折疊蛋白反應。Yang 等[54]研究發現，PRV 感染的早期階段ERS 標志物GRP78表達增加，提示ERS 被激活，而隨著時間的延長，GRP78的表達不再增加，表明PRV 只有在感染早期誘導ERS反應，且應激反應強弱與病毒復制水平并無平行關系，且在感染24 h時達到峰值；同時對UPR 3個分支的檢測發現，IRE1-XBP1 和eIF2α-ATF4 通路被激活，并通過PERK-eIF2α-CHOP-Bcl2 軸誘導細胞凋亡；在整體水平檢測ERS 與病毒復制的關系時用毒胡蘿卜素（Tg）、牛磺熊去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）和衣霉素（tunicamycin，Tm）處理細胞，其中Tg 處理過的細胞能使GRP78過量表達，顯著上調PRV 的復制，TUDCA 和Tm 下調病毒復制。Chen 等[16]在研究豬圓環病毒二型和PRV 合并感染時發現，ERS 可以通過PERK-eIF2α-ATF4-CHOP 途徑激活，且在感染36～72 h 內PRV 抑制豬圓環病毒二型的增殖；進一步的研究表明，PRV 在二者合并感染中起主導作用，并進一步激活IRE1-XBP1-EDEM 途徑，一定程度上增強了細胞凋亡。但關于PRV 激活ERS 引起UPR、炎癥反應、細胞自噬、凋亡等生物學過程之間的級聯機制尚不明確。

2.3 馬立克病病毒

馬立克病病毒（MDV）屬于皰疹病毒科、α 皰疹病毒亞科、馬立克病病毒屬。Neerukonda 等[17]在研究馬立克病病毒感染誘導UPR 時發現，MDV激活UPR，通過增加GRP78/BIP 表達、促進XBP1剪接和誘導α-甘露糖苷酶樣蛋白表達等增強ERS；MDV 在體內感染過程中可檢測到部分UPR激活，其調節水平受MDV 癌蛋白meq 的影響，其后在MDV 誘導的原發性淋巴瘤中發現ATF6被激活，提示ATF6在腫瘤發展中起一定作用[55]。MDV編碼的極早期或早期蛋白可能會阻斷UPR 激活，防止UPR 感受器長時間激活而導致的細胞凋亡，以促進自身復制。

2.4 鴨腸炎病毒

鴨腸炎病毒（DEV）又稱鴨瘟病毒（duck plague virus，DPV），是皰疹病毒科α 皰疹病毒亞科的成員。DEV 感染會引起雛鴨的組織損傷、淋巴管受損和血管損傷等，是一種急性、敗血癥傳染病[56]。Yin 等[57]發現DEV 感染觸發機體ERS，表現為GRP78 表達增加和內質網形態的擴張，DEV 復制增加；感染鴨胚成纖維細胞后，PERK和IRE1被激活，二者還可能參與DEV 誘導的自噬。Zhang等[18]利用中國標準攻毒株DEV（DEV-CSC）誘導鴨胚成纖維細胞，DEV-CSC 感染可顯著降低DEF 細胞內Ca2+水平，抑制細胞活力，誘導細胞凋亡，提示DEV-CSC 感染顯著上調CHOP、GRP78 和ATF6的表達，可能是由于ERS 形成的微環境有利于DEV 的復制，但其中的分子機制和相關聯級反應還有待研究，特別是促凋亡機制；大劑量DEVCSC 感染通過Ca2+介導的ERS/UPR 激活細胞凋亡，這一機制可能與鈣網蛋白有關。在DEV 感染后，鈣網蛋白在Ca2+穩態和ERS/UPR 誘導中的作用也需要進一步的研究。

2.5 其他皰疹病毒

除了上述幾種皰疹病毒外，還有其他多種皰疹病毒及其亞型引起內質網的應激并激活未折疊蛋白反應。如γ皰疹病毒亞科的卡波西肉瘤相關皰疹病毒（kaposis sarcomaassociated herpesvirus，KSHV）[58-59]、皰疹病毒家族β亞群的原型致病成員之一人巨細胞病病毒（human cytomegalo virus，HCMV）[60-61]、水痘帶狀皰疹病病毒（varicellazoster virus，VZV）[62]、Epstein-Barr 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）[63]等，均可不同程度地激活未折疊蛋白的1 條或幾條信號通路，從而抑制或促進病毒的復制，影響細胞的凋亡。

3 展望

皰疹病毒是無處不在的雙鏈DNA 包膜病毒，會造成終生感染并導致一系列疾病。其不同成員在感染過程中激活的ERS 所表現出的對病毒感染、復制的影響既有共性，又呈現出差異。病毒誘導的差異可能與糖基化、磷酸化蛋白數量和位置等有關，也與病毒復制時宿主細胞與特定病毒受體結合有關，被不同的伴侶分子識別，從而進入不同的加工成熟路徑，并由此向內質網壓力感受系統傳導不同水平的壓力信號。此外，ERS 反應是保守的應激反應，可以感知和響應內質網蛋白穩態，UPR 作為對ERS 的響應，通過轉錄因子PERK、IRE1 和ATF6 的聯合作用，減弱蛋白質瞬時翻譯，選擇性地上調反應基因，提高蛋白質折疊能力，并降解末端錯誤折疊的蛋白質，使內質網恢復穩態。但是，由于皰疹病毒基因組編碼多達11種不同的囊膜糖蛋白，其復制和轉錄翻譯必然占用大量內質網資源，極易超出內質網穩態，造成ERS 和UPR，最終介導細胞的凋亡。部分皰疹病毒似乎已經進化出某種篡改未折疊蛋白反應的機制，很可能抑制宿主細胞抗病毒轉錄反應，或促進自身復制的相關基因轉錄。到目前為止，有效的ERS 誘導藥物毒胡蘿卜素和衣霉素在UPR 研究中發揮了很大作用，但這些藥物通常不能概括病理狀態下的ERS，而且它們也有已知的靶點效應。所以研究皰疹病毒自然感染引起ERS 之間的分子機制和病毒與宿主之間反饋機制，可發現病毒復制、轉錄和翻譯的關鍵節點，為疫苗研制和抗病毒藥物研究奠定理論基礎。但這些途徑仍有許多未知之處，但越來越清楚的是，ERS 和UPR 不僅關聯皰疹病毒還與許多人類疾病密切相關。探究UPR 的分子機制對許多人類疾病和動物疫病以及設計通過調節UPR 來治療疾病或疫病具有重要意義。